For å fremme må vekstkjegler utøve trekkraftkrefter mot det ytre miljø. Genereringen av trekkraftkrefter er avhengig av aktindynamikk og clutchkobling. Den nåværende studien beskriver metoder for å analysere aktindynamikk, clutchkobling og trekkraft krefter for vekst kjegle fremskritt.
For å etablere funksjonelle nettverk må nevroner migrere til sine passende destinasjoner og deretter utvide axoner mot målcellene. Disse prosessene avhenger av fremskrittene av vekstkjegler som ligger på spissen av nevritter. Axonal vekst kjegler generere drivkrefter ved å føle sin lokale mikromiljø og modulere cytoskeletal dynamikk og actin-adhesion kobling (clutch kobling). Tiår med forskning har ført til identifisering av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og nedstrøms signalkaskader for regulering av nevronmigrasjon og axonal veiledning; Imidlertid begynner de molekylære maskinene som kreves for å generere krefter for å drive vekstkjeglen fremover og navigasjonen bare å bli belyst. I forkant av nevronale vekstkjegler gjennomgår aktinfilamenter retrograd strømning, som drives av aktinpolymerisering og actomyosin-sammentrekning. En koblingskobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstrat genererer trekkraftkrefter for vekstkjeglefremgang. Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning. Viktig, når den kombineres med en F-aktinmarkør Lifeact, kan denne teknikken kvantifisere 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten og 2) koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet. Begge er kritiske variabler for å generere krefter for vekstkjeglefremgang og navigasjon. I tillegg beskriver den nåværende studien en detaljert protokoll for trekkraftmikroskopi, som kan kvantifisere 3) trekkraft generert av vekstkjegler. Ved å koble sammen analysene av enkeltflekkavbildning og trekkraftmikroskopi, kan etterforskerne derfor overvåke den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglefremgang og navigasjon.
I den utviklende virveldyrhjernen gjennomgår nevroner forseggjort organiserte migrasjoner og prosjektaksoner mot passende synaptiske partnere for å etablere funksjonelle nevronnettverk1,2,3. Vekstkjegler, som er sensoriske og motile strukturer plassert på spissen av nevritter, bestemmer hastigheten og retningen for nevronal migrasjon og axon utvekst3,4,5. Siden nevroner er omgitt av tettpakkede miljøer, må vekstkjegler utøve krefter mot miljøet for å komme seg fremover6,7. For å forstå mekanismene som ligger til grunn for nevronmigrasjon og axonal veiledning, er analyser av molekylærmekanikk for vekstkjeglefremgang avgjørende.
Tiår med analyse har avslørt at trekkraft for å drive vekstkjeglefremgang genereres av “clutch” -mekanismen; denne mekanismen antas å fungere ikke bare i axonal vekst kjegle, men også i den ledende prosessvekst kjegle av migrerende nevroner8,9,10,11,12. Nemlig, aktinfilamenter (F-aktiner) i vekstkjegler polymeriserer i forkant og depolymeriserer proksimalt, skyver ut den ledende membranen13,14,15. Den resulterende kraften, sammen med actomyosin-sammentrekning, induserer bakre bevegelse av F-aktiner kalt retrogradstrømning7,11,16,17,18,19,20,21. Clutch- og celleadhesjonsmolekyler formidler mekanisk kobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstratet og overfører kraften til F-aktinstrøm på substratet, og genererer dermed trekkraft for vekstkjeglefremgang7,8,9,11,12,22 . Samtidig reduserer aktin-substratkoblingen F-aktinstrømningshastigheten og konverterer aktinpolymerisering til kraften for å stikke ut den ledende membranen9,10.
Axonal vekst kjegler føler lokale kjemiske signaler og transduce dem til en retningsmessig drivkraft for vekst kjegle navigasjon3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axonveiledningsmolekyl netrin-1 reseptoren som er slettet i kolorektal kreft (DCC), og aktiverer Rho guanosin triphosfat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrollprotein 42 (Cdc42) og Ras-relatert C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1), og deres nedstrøms kinase p21-aktiverte kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremmer 1) aktinpolymerisering, og Pak1 fosforylater et clutchmolekyl shootin122,26. Shootin1 samhandler med F-aktin retrograd strømning via en aktinbindende protein cortactin27. Shootin1 samhandler også med L1 celleadhesjonsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øker bindingsaffinitetene for kortlaktin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-mediert 2) clutchkobling24,27. Innenfor vekstkjeglen øker asymmetriske aktiveringer av aktinpolymerisering og koblingskobling 3) trekkraft på siden av netrin-1-kilden, og genererer dermed retningsbestemt drivkraft for vekstkjegle dreining (figur 1)24. Intensiv forskning de siste tiårene med hensyn til nevron migrasjon og axon veiledning har forbedret forståelsen av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og tilhørende nedstrøms signalkaskader2,10,28,29,30. Imidlertid begynner de molekylære maskinene å generere krefter for vekstkjeglefremgang bare å bli belyst; Dette kan tilskrives begrenset bruk av protokollene for mekanobiologiske analyser.
Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning16,18. Overvåking av F-aktin retrograd strømning har blitt grundig utført ved hjelp av super-oppløsning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi og total interferens refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i den nåværende studien bruker imidlertid et standard epifluorescensmikroskop og er dermed lett adopterbart1,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Kombinert med F-aktinmerking av Lifeact43, gir enkel flekkete avbildning mulighet for kvantifisering av aktinpolymeriseringshastigheten og koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet39,42. Den nåværende studien beskriver videre en detaljert protokoll for trekkraft kraftmikroskopi ved hjelp av en fluorescerende perle-innebygd polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metoden oppdager og kvantifiserer trekkraft under vekstkjeglen ved å overvåke kraftinduserte perlebevegelser44,45. En åpen kildekode trekkraft analyse kode er gitt, og metoden for kvantifisering trekkraft under vekst kjegle migrasjon forklares i detalj. Ved hjelp av enkel flekkete avbildning og trekkraft kraftmikroskopi, vil det bli lagt til rette for forståelse av den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglemigrasjon og navigasjon. Disse teknikkene gjelder også for å analysere molekylærmekanikken som ligger til grunn for dendritisk ryggradsforstørrelse, som er kjent for å være viktig i læring og hukommelse42.
Protokollene beskrevet i denne studien bruker kommersielt tilgjengelige materialer og mikroskopiutstyr som rutinemessig finnes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan etterforskere enkelt ta i bruk den nåværende enkeltflekkavbildningen og trekkraft kraftmikroskopi i studiene.
Flekkete avbildning kan analysere aktinpolymerisering og koblingskobling. I tillegg kan flekkete avbildning overvåke retrogradstrømmen av clutchmolekyler som shootin1 og cortactin, som samhandler med F-aktin retrograd strømning. Ved å bruke et TIRF-mikroskop kan den retrograde strømmen av celleadhesjonsmolekylet L1-CAM også overvåkes23,41; L1-CAM gjennomgår grep og skliatferd som gjenspeiler koblingseffektiviteten23,41. Selv om den nåværende studien benytter TMR-HaloTag-systemet for flekkete avbildning, er andre fluorescerende proteiner, som EGFP og monomerisk rødt fluorescerende protein, også tilgjengelig i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det viktigste for å visualisere aktinflekker er et lavt uttrykksnivå av fluorescerende aktin og belysningen av et minimumsområde (figur 2). I denne protokollen innhentes Signalene Lifeact og HaloTag-actin sekvensielt. Fordi aktin retrograd strømning er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, er analysen av F-aktin retrograd strømning og aktinpolymerisering upåvirket av sekvensiell bildeinnhenting av forskjellige fluorescerende kanaler (~1 s intervall). Lifeact er en mye brukt F-aktinmarkør, men kan konkurrere med aktinbindende proteiner47. Av ytterligere betydning kan Lifeact endre aktindynamikk, og dermed påvirke F-aktinstrukturer og cellemorfologien47,48,49.
Trekkraft mikroskopi kan oppdage krefter for å drive vekst kjegle forhånd. Ved å montere nevronene i en ekstracellulær matrise, kan etterforskere også analysere krefter generert i et semi-3D-miljø11. Høyforstørrelsesavbildning er viktig for nøyaktig kvantifisering av trekkraft fordi vekstkjegler genererer svake trekkraftkrefter7. Selv om andre metoder med nanopillarer eller stressfølsomme biosensorer også brukes til å måle trekkraft force50,51, er PAA gelbasert metode svært tilpasningsdyktig og muliggjør justering av substratstivitet ved å variere konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid41,44,52. I denne protokollen fremstilles PAA gel ved en endelig konsentrasjon på 3,75% akrylamid og 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivheten er innenfor rekkevidden av hjernevev (100-10,000 Pa)53,54,55. På grunn av tykkelsen på PAA gel (~ 100 μm), begrenser denne metoden bruken av høyforstørrelseslinser under mikroskopi. For å få bilder med høy forstørrelse, bør undersøkere bruke zoomfunksjonen i et konfokalt mikroskop for laserskanning.
Avslutningsvis muliggjør dagens flekkavbildning og trekkraftmikroskopi kvantitative analyser av de viktigste hendelsene i kraftgenerasjoner. Denne informasjonen vil være uvurderlig for å forbedre forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for vekstkjegleutvikling og navigasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble delvis støttet av AMED under tilskuddsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for forskere i tidlig karriere (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige sykdommer (T.M.), og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |