카나비노이드 전임상 연구를 위한 곤충 모델 시스템으로 담배 혼웜
Summary
본 프로토콜은 카나비노이드 연구에서 담배 혼웜 만두카 sexta 를 사용하기위한 교육 정보를 제공합니다. 여기에 설명된 방법은 칸 나비 디올 (CBD) 치료에 대한 응답으로 곤충 모델의 생리적 및 행동 변화를 모니터링하는 모든 필요한 공급 및 프로토콜을 포함한다.
Abstract
의학에서 카나비노이드에 대한 관심이 증가함에 따라 여러 포유류 모델 유기체가 알려지지 않은 제약 기능을 해명하는 데 사용되었습니다. 그러나, 많은 어려움은 카나비노이드 연구를 위한 비 포유류 모형 유기체의 발달을 필요로 하는 포유류 연구에 남아 있습니다. 저자는 담배 뿔벌레 만두카 sexta 새로운 곤충 모델 시스템으로 제안한다. 이 프로토콜은 다양한 양의 칸 나비 디올 (CBD)으로 인공 식단을 준비하고, 재배 환경을 설정하고, CBD 치료에 대한 응답으로 생리적 및 행동 적 변화를 모니터링하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 간략하게, 뿔벌레 알을 수신하는 즉시, 계란은 12:12 광어두운 주기에 25°C에서 1-3 일을 허용하였고, 무작위로 제어에 분배되기 전에 부화하였다(밀 배아 계 인공 식단; AD), 차량(AD + 0.1% 중형 체인 트리글리세라이드 오일; MCT 오일) 및 치료 그룹 (AD + 0.1 % MCT + 1 mM 또는 CBD2 mM). 미디어가 준비되면, 1 번째 인스타 애벌레는 나무 꼬치 스틱이있는 50 mL 테스트 튜브에 개별적으로 배치 된 다음 시험관은 치즈 천으로 덮여있었습니다. 측정은 CBD 관리에 대한 생리적 및 행동 적 반응을 위해 2 일 간격으로 수행되었습니다. 이 간단한 재배 절차는 연구원이 주어진 실험에서 큰 표본을 시험할 수 있게 합니다. 또한, 상대적으로 짧은 수명 주기는 연구원이 더 높은 포유류 모형 유기체에 있는 실험적인 디자인을 지원하는 데이터를 허용하는 동질적인 인구의 다세대에 칸 나비노이드 처리의 충격을 연구하는 것을 가능하게 합니다.
Introduction
지난 몇 년 동안, 대중의 관심은 간질 1, 파킨슨 병2, 다발성 경화증 및 칸 나비 디올 (CBD)을 가진 다양한 형태의 암4,5,6의 치료를 포함하여 치료 잠재력으로 인해 카나비노이드에 중점을 두었습니다. 대마초는 2018 년 농업 개선법에서 농업 상품으로 합법화되기 때문에, 공법 115-334 (2018 농장 법안), 대마초와 식품, 화장품 및 제약 산업의 카나비노이드 유도체는 기하 급수적으로 증가했습니다. 또한, 단일 카나비노이드 및 카나비노이드 혼합물의 임상 등급 분리는 인간 과목7, 세포주 5,8 및 다양한 동물 모델 시스템에서 성공적으로 테스트되었습니다9,10.
임상 시험은 특정 질병에 카나비노이드의 효능과 부작용을 검증하는 데 이상적입니다. 그러나, 임상 시험에 있는 수많은 도전이 있습니다, 윤리적/IRB 승인, 모집 및 과목의 보유를 포함하여 11. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 인간 유래 세포주는 비용 효율적이고, 다루기 쉽고, 윤리적 문제를 우회할 수 있고, 세포주로서 일관되고 재현 가능한 결과를 제공하기 때문에 다양한 인간 세포주를 사용하였다.12 다른 세포 및 화학 물질의 교차 오염이 없는 세포의 순수한 집단이다.
Alves et al. (2021)13 은 태반의 특수 세포인 태반 트로포블라스트에서 투여 의존형 방식으로 CBD를 테스트했는데, 이는 태아 이식 및 열화된 모성 자궁과의 상호 작용에 필수적인 역할을 하는 태반의 전문 세포입니다14. 그들의 결과는 CBD가 세포 생존 가능성 손실, 세포 주기 진행 중단 및 세포 세포 흡입 유도를 일으키는 원인이 되었다는 것을 보여주었습니다. 이러한 관측은 임산부에 의해 대마초 사용의 잠재적 인 부정적인 영향을 보여줍니다13. 마찬가지로, 일련의 세포주들은 또한 인간 질병, 특히 다양한 형태의 암에서 CBD의 약리학적 효과를 검사하는 데 사용되었습니다. 시험관 내 연구는 성공적으로 췌장15, 유방8 및 대장암 세포16에서 항암 효과를 입증했습니다. 그러나, 널리 이용 가능하고 취급하기 쉬운 동안, HeLa와 같은 특정 세포주, HEK293는 그들의 성장 조건 또는 취급17에 있는 변경 때문에 유전및 표현적인 변경에 경향이 있습니다.
대마초 연구에서는 마우스18, 기니 피그19 및 rabbit19와 같은 작은 동물에서 개20, piglet21, monkey22, horse23과 같은 큰 동물에 이르기까지 다양한 동물 모델 시스템이 알려지지 않은 치료 효과를 탐구하는 데 사용되었습니다. 마우스는 인간에 대한 해부학적, 생리적, 유전적 유사성으로 인해 카나비노이드 연구를 가장 선호하는 동물 모델 시스템이었습니다24. 가장 유의하게, 마우스는 인간에 있는 그들의 신경계에 있는 CB1/2 수용체가 있습니다. 그(것)들은 또한 더 쉬운 유지 보수 및 풍부한 유전 자원을 가진 인간 적인 과목 보다는 더 짧은 수명 주기가, 따라서 전체 수명 주기 내내 칸 나비 노이드의 효력을 감시하는 것이 훨씬 쉽게 만듭니다. 포유류 시스템은 널리 사용되며 CBD가 발작 장애1, 외상 후 스트레스 장애9, 구강 궤양 25 및 치매와 같은 증상을 완화한다는 것을 성공적으로 입증했습니다10. 마우스 모델은 또한 큰 동물과 인간26에서 매우 어려운 지역 사회 내에서 개인의 사회적 상호 작용 연구를 가능하게했다26.
동물 모델 시스템의 모든 장점에도 불구하고 여전히 비용이 많이 들며 약물 투여 및 데이터 수집 중에 집중 치료가 필요합니다. 추가적으로, 실험 디자인 및 엄격27에 있는 한계 때문에 불변성 및 인간 조건의 가난한 회수 때문에 연구에서 마우스를 사용하는 감시가 있습니다.
카나비노이드의 의료/전임상 연구에 대한 수요가 증가함에 따라 비 포유류 모델 시스템이 필요합니다. 무척추 동물 모델은 전통적으로 척추 동물 모델에 비해 독특한 이점을 부여했습니다. 중요한 이득은 많은 견본을 양육하고 연구원이 유전적으로 균일한 인구의 다세대 를 감시하는 가능하게 하는 용이하고 낮은 비용을 포함합니다28. 최근 연구는 과일 비행을 입증, Drosophila 멜라노가스터, 공급 행동을 변조에 칸 나비 노이드의 약리적 기능을 조사하는 효과적인 곤충 모델 시스템으로29. 곤충 모델 시스템 중, 저자는 담배 뿔벌레에 초점을 맞추고, 만두카 sexta, 또한 캐롤라이나 스핑크스 나방 또는 매 나방으로 알려진, 칸 나비 노이드 연구를위한 새로운 곤충 모델 시스템으로.
만두카 섹스타는 스핑기다의 가족에 속한다. 곤충은 미국 남부에서 가장 흔한 식물 해충으로, 그들은 천체 식물을 먹입니다. 곤충 모델은 곤충 생리학, 생화학, 신경 생물학 및 약물 상호 작용 연구에 오랜 역사를 가지고 있습니다. Manduca sexta의 연구 포트폴리오에는 필수 세포 프로세스의 분자 수준 이해를 허용하는 초안 게놈 서열이 포함되어 있습니다30. 이 모델 시스템의 또 다른 중요한 이점은 18-25일 동안 의 길이가 100mm 이상, 무게는 10g에 달하는 큰 크기입니다. 큰 크기는 연구원이 CBD 치료에 대한 응답으로 실시간으로 형태학적 및 행동 변화를 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 크기 때문에, 전기 생리학적 반응은 고해상도 현미경 설정 없이 애벌레에서 해부된 신경을 포함하여 복부 신경계로 검토되었다. 독특한 기능을 통해 연구자들은 투여된 카나비노이드(들)에 대한 급성 및 장기 반응을 쉽게 조사할 수 있습니다.
이러한 다양성에도 불구하고, M. sexta는 최근에 대마초와 카나비노이드 연구에 대한 실험 모델로의 적합성에 대한 탐구되었습니다. 2019년, 저자는 대마초가 곤충 초식 동물30,31로부터 자신을 보호하기 위해 Cannabidiol을 생산하기 위해 진화했다는 가설을 해결하기 위해 처음으로 곤충 모델 시스템을 사용했다. 그 결과 식물이 CBD를 먹이 억제책으로 악용하고 해충 곤충 M. sexta 애벌레의 성장을 억제하고 사망률 증가를 유발하는 것으로 나타났습니다31. 이 연구는 또한 CBD의 캐리어로서 에탄올의 잠재적 인 차량 효과를 식별하는 술에 취한 에탄올 애벌레에 CBD의 구출 효과를 입증했습니다. 도시된 바와 같이, 곤충 모델 시스템은 다른 동물 시스템에 보다 적은 인건비와 비용으로 3-4 주 이내에 칸 나비 노이드의 치료 효과를 효과적으로 조사했다. 곤충 모델은 카나비노이드 수용체 (즉, CB1/2 수용체 없음)가 부족하지만, 모델 시스템은 카나비노이드 수용체 독립적 인 방식을 통해 칸 나비 노이드의 약리적 역할을 이해하는 귀중한 도구를 제공합니다.
이 연구의 저자는 이전에 카나비노이드 연구를위한 모델 시스템으로 담배 hornworm와 함께 일했습니다31. M. sexta를 사용하는 이점과 위험을 신중하게 고려한 후, 우리는 미래의 전임상 실험실 사용을 위한 기회를 허용하는 전임상 시험을 위한 식단의 적절한 관리 및 준비와 관련된 방법을 제공했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수유 연구는 CBD (2 mM)의 고용량이 곤충의 성장을 억제하고 사망률을 증가시켰다는 것을 보여 주었다31. 곤충 모델은 또한 에탄올에 대한 민감성을 보였다; 그러나 CBD는 에탄올 독성을 효과적으로 취화하여 생존율, 식이 소비 및 식품 검색 행동을 대조군과 유사한 수준으로 증가시켰습니다(그림 3A, B)31. 설명된 곤충 모델 시스템…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 콜로라도 주립 대학 – 푸에블로와 과학 ICT부 (2021-DD-UP-0379)와 춘천시 (대마 R&D 및 산업화, 2020-2021)의 대마초 연구 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
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