دودة قرن التبغ كنظام نموذجي للحشرات للدراسات ما قبل السريرية للقنب
Summary
يوفر البروتوكول الحالي معلومات تعليمية لاستخدام دودة قرن التبغ Manduca sexta في أبحاث القنب. تتضمن الطريقة الموضحة هنا جميع الإمدادات والبروتوكولات اللازمة لرصد التغيرات الفسيولوجية والسلوكية لنموذج الحشرات استجابة لعلاج الكانابيديول (CBD).
Abstract
مع زيادة الاهتمام بالقنب في الطب ، تم استخدام العديد من الكائنات الحية النموذجية للثدييات لتوضيح وظائفها الصيدلانية غير المعروفة. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من الصعوبات في أبحاث الثدييات ، مما يستلزم تطوير كائنات حية نموذجية غير ثديية لأبحاث القنب. يقترح المؤلفون دودة قرن التبغ Manduca sexta كنظام نموذجي جديد للحشرات. يوفر هذا البروتوكول معلومات حول إعداد النظام الغذائي الاصطناعي بكميات متفاوتة من الكانابيديول (CBD) ، وإنشاء بيئة زراعية ، ومراقبة التغيرات الفسيولوجية والسلوكية استجابة لعلاج اتفاقية التنوع البيولوجي. باختصار ، عند تلقي بيض الدودة القرنية ، سمح للبيض 1-3 أيام عند 25 درجة مئوية في دورة 12:12 فاتحة مظلمة للفقس قبل توزيعها عشوائيا في السيطرة (نظام غذائي اصطناعي قائم على جرثومة القمح; AD) ، مركبة (AD + 0.1 ٪ زيت الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة ؛ زيت MCT) ومجموعات العلاج (AD + 0.1٪ MCT + 1 mM أو 2 mM من CBD). بمجرد إعداد الوسائط ، تم وضع يرقات 1st instar بشكل فردي في أنبوب اختبار سعة 50 مل مع عصا سيخ خشبية ، ثم تم تغطية أنبوب الاختبار بقماش قطني. تم أخذ القياسات في فترات 2 أيام للاستجابات الفسيولوجية والسلوكية لإدارة اتفاقية التنوع البيولوجي. يسمح إجراء الزراعة البسيط هذا للباحثين باختبار عينات كبيرة في تجربة معينة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دورات الحياة القصيرة نسبيا تمكن الباحثين من دراسة تأثير علاجات القنب على مدى أجيال متعددة من السكان المتجانسين ، مما يسمح للبيانات بدعم التصميم التجريبي في الكائنات الحية النموذجية للثدييات العليا.
Introduction
على مدى السنوات الماضية ، تركز اهتمام الجمهور على القنب بسبب إمكاناته العلاجية ، بما في ذلك علاج الصرع1 ومرض باركنسون2 والتصلب المتعدد3 وأشكال مختلفة من السرطان4،5،6 مع الكانابيديول (CBD). نظرا لأن القنب يتم تقنينه كسلعة زراعية في قانون التحسين الزراعي لعام 2018 ، والقانون العام 115-334 (مشروع قانون المزرعة لعام 2018) ، فقد زاد القنب ومشتقاته من القنب في الصناعات الغذائية ومستحضرات التجميل والصناعات الدوائية بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار العزلات السريرية من القنب الفردي ومخاليط القنب بنجاح في البشر7 ، وخطوط الخلايا5،8 ، وأنظمة النماذج الحيوانية المتنوعة9،10.
ستكون التجربة السريرية مثالية للتحقق من فعالية القنب وآثاره الضارة على مرض معين. ومع ذلك ، هناك العديد من التحديات في التجارب السريرية ، بما في ذلك الموافقة الأخلاقية / IRB ، والتوظيف ، والاحتفاظ بالموضوعات11. للتغلب على هذه العقبات، تم استخدام خطوط الخلايا البشرية المختلفة لأن خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان فعالة من حيث التكلفة، وسهلة التعامل معها، ويمكن أن تتجاوز القضايا الأخلاقية، وتوفر نتائج متسقة وقابلة للتكرار لأن خطوط الخلايا هي “مجموعة نقية من الخلايا التي ليس لديها تلوث متبادل للخلايا والمواد الكيميائية الأخرى”12.
اختبر Alves et al. (2021)13 CBD بطريقة تعتمد على الجرعة في الأرومات الغاذية المشيمة ، وهي خلايا متخصصة في المشيمة تلعب دورا أساسيا في زرع الجنين والتفاعل مع رحم الأم المختل14. أظهرت نتائجهم أن اتفاقية التنوع البيولوجي تسببت في فقدان صلاحية الخلية ، واضطراب تطور دورة الخلية ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وتبين هذه الملاحظات الآثار السلبية المحتملة لتعاطي القنب من جانب النساء الحوامل(13). وبالمثل ، تم استخدام سلسلة من خطوط الخلايا أيضا لفحص الآثار الدوائية لاتفاقية التنوع البيولوجي في الأمراض البشرية ، ولا سيما أشكال مختلفة من السرطان. أظهرت الدراسات المخبرية بنجاح تأثيرات مضادة للسرطان في خلايا سرطان البنكرياس15 والثدي8 وسرطان القولون والمستقيم16. ومع ذلك ، في حين أن خطوط الخلايا المحددة مثل HeLa و HEK293 متاحة على نطاق واسع وسهلة التعامل معها ، إلا أنها عرضة للتغيرات الجينية والمظهرية بسبب التغيرات في ظروف نموها أو التعامل معها17.
في أبحاث القنب ، تم استخدام العديد من أنظمة النماذج الحيوانية ، بدءا من الحيوانات الصغيرة مثل mouse18 و guinea-pig19 و rabbit19 إلى الحيوانات الكبيرة مثل canine20 و piglet21 و monkey22 و horse23 ، لاستكشاف الآثار العلاجية غير المعروفة. كانت الفئران أكثر أنظمة النماذج الحيوانية تفضيلا لأبحاث القنب بسبب تشابهها التشريحي والفسيولوجي والجيني مع البشر24. الأهم من ذلك ، أن الفئران لديها مستقبلات CB1/2 في نظامها العصبي ، والتي توجد في البشر. كما أن لديها دورة حياة أقصر من البشر ، مع سهولة الصيانة والموارد الوراثية الوفيرة ، مما يجعل من الأسهل بكثير مراقبة آثار القنب طوال دورة الحياة بأكملها. يستخدم نظام الثدييات على نطاق واسع وقد أثبت بنجاح أن اتفاقية التنوع البيولوجي تخفف من اضطرابات النوبات1 ، واضطراب ما بعد الصدمة9 ، وقرحة الفم25 ، والأعراض الشبيهة بالخرف10. كما مكن نموذج الفأر من إجراء دراسة للتفاعل الاجتماعي للأفراد داخل مجتمع صعب للغاية في الحيوانات الكبيرة والبشر26.
على الرغم من جميع مزايا نظام النموذج الحيواني ، إلا أنه لا يزال مكلفا ويتطلب عناية مركزة أثناء إعطاء الدواء وجمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تدقيق في استخدام الفئران في البحث بسبب عدم إمكانية التكرار وسوء تلخيص الظروف البشرية بسبب القيود المفروضة على التصميم التجريبي والصرامة27.
مع تزايد الطلب على الدراسات الطبية / ما قبل السريرية للقنب ، هناك حاجة إلى نظام نموذجي غير الثدييات. تمنح نماذج اللافقاريات تقليديا فوائد مميزة على نماذج الفقاريات. وتشمل الفوائد الهامة سهولة وانخفاض تكلفة تربية العديد من العينات وتمكين الباحثين من مراقبة أجيال متعددة من السكان المتجانسين وراثيا28. أثبتت دراسة حديثة أن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، هي نظام نموذج حشري فعال للتحقيق في الوظائف الدوائية للقنب في تعديل سلوكيات التغذية29. من بين أنظمة نماذج الحشرات ، ركز المؤلفون على دودة قرن التبغ ، Manduca sexta ، المعروفة أيضا باسم عثة أبو الهول كارولينا أو عثة الصقر ، كنظام نموذج حشري جديد لأبحاث القنب.
ينتمي Manduca sexta إلى عائلة Sphingidae. الحشرة هي الآفة النباتية الأكثر شيوعا في جنوب الولايات المتحدة ، حيث تتغذى على النباتات الباذنجانية. يتمتع نموذج الحشرات بتاريخ طويل في البحث في فسيولوجيا الحشرات والكيمياء الحيوية والبيولوجيا العصبية ودراسات التفاعل الدوائي. تتضمن محفظة أبحاث ماندوكا سيكستا مسودة تسلسل الجينوم، مما يسمح بفهم العمليات الخلوية الأساسية على المستوى الجزيئي30. فائدة حاسمة أخرى لهذا النظام النموذجي هي حجمه الكبير ، حيث يصل طوله إلى أكثر من 100 مم ووزنه 10 جم في 18-25 يوما من تطور اليرقات. يتيح الحجم الكبير للباحثين مراقبة التغيرات المورفولوجية والسلوكية بسهولة في الوقت الفعلي استجابة لعلاج اتفاقية التنوع البيولوجي. أيضا ، بسبب الحجم ، تم فحص الاستجابات الكهروفسيولوجية مع الجهاز العصبي البطني ، بما في ذلك العقد التي تم تشريحها من اليرقات دون إعدادات مجهر عالية الدقة. تسمح الميزة الفريدة للباحثين بالتحقيق بسهولة في الاستجابات الحادة والطويلة الأجل للقنب (القنب) الذي يتم إعطاؤه.
على الرغم من هذا التنوع ، لم يتم استكشاف M. sexta إلا مؤخرا لملاءمته كنموذج تجريبي لدراسات القنب والقنب. في عام 2019 ، استخدم المؤلفون نظام نموذج الحشرات لأول مرة لمعالجة الفرضية القائلة بأن القنب قد تطور لإنتاج الكانابيديول لحماية نفسه من الحيوانات العاشبة الحشرية30,31. وأظهرت النتيجة بوضوح أن النباتات استغلت اتفاقية التنوع البيولوجي كرادع للتغذية ومنعت نمو حشرة الآفات M. sexta caterpillar ، فضلا عن التسبب في زيادة الوفيات31. وأظهرت الدراسة أيضا آثار إنقاذ اتفاقية التنوع البيولوجي على يرقات الإيثانول المخمورة ، وتحديد تأثير السيارة المحتمل للإيثانول كحامل لاتفاقية التنوع البيولوجي. كما هو موضح ، قام نظام نموذج الحشرات بالتحقيق بفعالية في الآثار العلاجية للقنب في غضون 3-4 أسابيع مع عمالة وتكاليف أقل من الأنظمة الحيوانية الأخرى. على الرغم من أن نموذج الحشرات يفتقر إلى مستقبلات القنب (أي عدم وجود مستقبلات CB1/2) ، فإن النظام النموذجي يوفر أداة قيمة لفهم الأدوار الدوائية للقنب من خلال طريقة مستقلة عن مستقبلات القنب.
عمل مؤلفو هذه الدراسة سابقا مع دودة قرن التبغ كنظام نموذجي لأبحاث القنب31. بعد دراسة متأنية لفوائد ومخاطر استخدام M. sexta ، قدمنا طريقة تنطوي على الرعاية المناسبة وإعداد النظام الغذائي للتجارب قبل السريرية التي تسمح بفرص للاستخدام المختبري قبل السريري في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرت دراسة التغذية أن الجرعات العالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر) منعت نمو الحشرة وزادت من الوفيات31. أظهر نموذج الحشرات أيضا حساسية للإيثانول. ومع ذلك ، فإن اتفاقية التنوع البيولوجي تزيل السموم بشكل فعال من سمية الإيثانول ، مما زاد من معدل بقائها على قيد الحياة ، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل معهد أبحاث القنب في جامعة ولاية كولورادو – بويبلو ووزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (2021-DD-UP-0379) ، ومدينة تشنتشون (القنب R & D والتصنيع ، 2020-2021).
Materials
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- . Trophoblast Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021)
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. . Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).
