Den nuværende protokol giver instruktionsinformation til brug af tobak hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Den metode, der er beskrevet her, omfatter alle nødvendige forsyninger og protokoller til at overvåge fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer af insektmodellen som reaktion på cannabidiol (CBD) behandling.
Med øget opmærksomhed på cannabinoider i medicin er flere pattedyrsmodelorganismer blevet brugt til at belyse deres ukendte farmaceutiske funktioner. Der er dog stadig mange vanskeligheder i pattedyrsforskning, hvilket kræver udvikling af ikke-pattedyrs modelorganismer til cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobak hornorm Manduca sexta som en ny insekt model system. Denne protokol giver oplysninger om forberedelse af den kunstige kost med varierende mængder cannabidiol (CBD), opsætning af et dyrkningsmiljø og overvågning af deres fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer som reaktion på CBD-behandling. Kort sagt, efter at have modtaget hornorm æg, æggene fik lov 1-3 dage ved 25 °C på en 12:12 lyse-mørk cyklus til at luge, før de tilfældigt distribueres til kontrol (hvedekim-baseret kunstig kost; AD), køretøj (AD + 0,1% mellemkædet triglyceridolie; MCT olie) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når mediet var forberedt, blev 1. instar larver individuelt placeret i et 50 mL reagensglas med en træspydpind, og derefter blev reagensglasset dækket af en osteklud. Målinger blev taget med 2 dages intervaller for fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner på CBD-administrationen. Denne enkle dyrkningsprocedure gør det muligt for forskere at teste store prøver i et givet eksperiment. Derudover gør de relativt korte livscyklus det muligt for forskere at studere virkningen af cannabinoidbehandlinger over flere generationer af en homogen befolkning, hvilket giver mulighed for data til støtte for et eksperimentelt design i højere pattedyrmodelorganismer.
I løbet af de seneste år har offentlighedens opmærksomhed været centreret om cannabinoider på grund af deres terapeutiske potentiale, herunder behandling af epilepsi1, Parkinsons sygdom2, multipel sklerose3 og forskellige former for kræft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Da Cannabis er legaliseret som en landbrugsvare i Agricultural Improvement Act of 2018, er offentlig lov 115-334 (farm billen fra 2018), cannabis og dets cannabinoidderivater i fødevare-, kosmetik- og medicinalindustrien steget eksponentielt. Derudover, kliniske kvalitet isolater af enkelte cannabinoider og cannabinoid blandinger er blevet testet med succes i mennesker7, cellelinjer5,8, og forskellige dyr model systemer9,10.
Et klinisk forsøg ville være ideelt til validering af effekten og bivirkningerne af cannabinoider på en bestemt sygdom. Der er dog mange udfordringer i kliniske forsøg, herunder etisk/IRB-godkendelse, rekruttering og fastholdelse af forsøgspersonerne11. For at overvinde disse forhindringer blev forskellige menneskelige cellelinjer brugt, fordi menneskeafledte cellelinjer er omkostningseffektive, nemme at håndtere, kan omgå de etiske spørgsmål og give ensartede og reproducerbare resultater, da cellelinjerne er en ‘ren population af celler, der ikke har krydskontaminering af andre celler og kemikalier’12.
Alves et al. (2021)13 testede CBD på en dosisafhængig måde i placental trofoblaster, som er specialiserede celler i moderkagen, der spiller en væsentlig rolle i embryoimplantatering og interaktion med den cidualiserede moderlige livmoder14. Deres resultater viste, at CBD forårsagede tab af celle levedygtighed, afbrydelse af cellecyklusforløbet og apoptose induktion. Disse observationer viser de potentielle negative virkninger af cannabisbrug af gravide kvinder13. Ligeledes blev en række cellelinjer også brugt til at undersøge de farmakologiske virkninger af CBD i menneskelige sygdomme, især forskellige former for kræft. In vitro-undersøgelserne viste med succes anti-cancer effekter i bugspytkirtlen15, bryst8, og kolorektal cancerceller16. Men, mens der er bredt tilgængelige og let at håndtere, specifikke cellelinjer såsom HeLa, HEK293 er tilbøjelige til genetiske og fænotypiske ændringer på grund af ændringer i deres vækstbetingelser eller håndtering17.
I Cannabis forskning, forskellige dyr model systemer, lige fra små dyr som mouse18, marsvin19, og kanin19 til store dyr som hunde20, gris21, monkey22, horse23, er blevet brugt til at udforske ukendte terapeutiske virkninger. Mus har været det mest foretrukne dyremodelsystem til cannabinoidforskning på grund af deres anatomiske, fysiologiske og genetiske lighed med mennesker24. Mest markant har mus CB1/2 receptorer i deres nervesystem, som er til stede hos mennesker. De har også en kortere livscyklus end mennesker, med lettere vedligeholdelse og rigelige genetiske ressourcer, hvilket gør det meget lettere at overvåge virkningerne af cannabinoider gennem en hel livscyklus. Pattedyrsystemet er meget udbredt og har med succes vist, at CBD lindrer anfaldsforstyrrelser1, posttraumatisk stressforstyrrelse9, orale sår25 og demenslignende symptomer10. Musemodellen har også muliggjort en social interaktionsundersøgelse af individer i et samfund, som er yderst vanskeligt hos store dyr og mennesker26.
På trods af alle fordelene ved dyremodelsystemet er det stadig dyrt og kræver intensiv pleje under lægemiddeladministration og dataindsamling. Derudover er der kontrol af at bruge mus i forskning på grund af uigenkaldelighed og dårlig rekapitulation af menneskelige forhold på grund af begrænsninger i eksperimentelt design og stringens27.
Med den stigende efterspørgsel efter medicinske / prækliniske undersøgelser af cannabinoider er der behov for et ikke-pattedyrmodelsystem. Hvirvelløse modeller traditionelt tillagt karakteristiske fordele i forhold til hvirveldyr modeller. De betydelige fordele omfatter den lette og lave pris ved at opdrætte mange prøver og gøre det muligt for forskere at overvåge flere generationer af genetisk homogene populationer28. En nylig undersøgelse viste, at frugtfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodelsystem til at undersøge farmakologiske funktioner af cannabinoider i modulerende fodringsadfærd29. Blandt insektmodelsystemerne fokuserede forfatterne på tobakshornormen Manduca sexta, også kendt som Carolina sfinxmot eller hawk moth, som et nyt insektmodelsystem til cannabinoidforskning.
Manduca sexta tilhører Sphingidaes familie. Insektet er det mest almindelige plante skadedyr i det sydlige USA, hvor de fodrer med solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie inden for forskning i insektfysiologi, biokemi, neurobiologi og lægemiddelinteraktionsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje omfatter et udkast til genomsekvens, der giver mulighed for en molekylær forståelse af væsentlige cellulære processer30. En anden afgørende fordel ved dette modelsystem er dets store størrelse og når mere end 100 mm i længden og 10 g i vægt i de 18-25 dages larveudvikling. Den store størrelse gør det muligt for forskere nemt at overvåge morfologiske og adfærdsmæssige ændringer i realtid som reaktion på CBD-behandlingen. På grund af størrelsen blev elektrofysiologiske reaktioner også undersøgt med abdominalnervesystemet, herunder ganglier dissekeret fra larverne uden mikroskopindstillinger i høj opløsning. Den unikke funktion gør det muligt for forskere at let undersøge akutte og langsigtede reaktioner på de administrerede cannabinoid(er).
På trods af en sådan alsidighed er M. sexta først for nylig blevet undersøgt for sin egnethed som en eksperimentel model for Cannabis og cannabinoidstudier. I 2019 brugte forfatterne insektmodelsystemet for første gang til at adressere hypotesen om, at Cannabis har udviklet sig til at producere Cannabidiol for at beskytte sig mod insekt planteædere30,31. Resultatet viste tydeligt, at planterne udnyttede CBD som en fodrings afskrækkende virkning og hæmmede væksten af skadedyrsinsekttet M. sexta larve, samt forårsagede øget dødelighed31. Undersøgelsen viste også, at CBD’s redning af virkningerne på berusede ethanollarver identificerede den potentielle køretøjseffekt af ethanol som bærer af CBD. Som vist undersøgte insektmodelsystemet effektivt de terapeutiske virkninger af cannabinoider inden for 3-4 uger med mindre arbejdskraft og omkostninger end andre dyresystemer. Selvom insektmodellen mangler cannabinoidreceptorer (dvs. ingen CB1/2-receptorer), giver modelsystemet et værdifuldt værktøj til at forstå cannabinoidernes farmakologiske roller gennem en cannabinoid receptor-uafhængig måde.
Forfatterne af denne undersøgelse har tidligere arbejdet med tobak hornorm som et modelsystem for cannabinoid forskning31. Efter nøje overvejelse af fordele og risici ved at bruge M. sexta, har vi givet en metode, der involverer korrekt pleje og forberedelse af kost til prækliniske forsøg, der giver mulighed for fremtidig præklinisk laboratoriebrug.
Fodringsundersøgelsen viste, at høje doser af CBD (2 mM) hæmmede insektets vækst og øgede dødelighed31. Insektmodellen viste også følsomhed over for ethanol; CBD afgiftede dog effektivt ethanoltoksiciteten og øgede deres overlevelsesrate, kostforbrug og madsøgningsadfærd til lignende niveauer som kontrolgruppen (Figur 3A, B)31. Det beskrevne insektmodelsystem består af tre kritiske trin: (1) at sikre , at M. sex…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Ministeriet for Videnskab og IKT (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon by (Hemp R &D og industrialisering, 2020-2021).
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |