Het huidige protocol biedt instructieve informatie voor het gebruik van tabakshoornworm Manduca sexta in cannabinoïde onderzoek. De hier beschreven methode omvat alle noodzakelijke benodigdheden en protocollen om fysiologische en gedragsveranderingen van het insectenmodel te volgen als reactie op cannabidiol (CBD) -behandeling.
Met de toegenomen aandacht voor cannabinoïden in de geneeskunde, zijn verschillende zoogdiermodelorganismen gebruikt om hun onbekende farmaceutische functies op te helderen. Er zijn echter nog veel problemen in het onderzoek naar zoogdieren, wat de ontwikkeling van niet-zoogdiermodelorganismen voor cannabinoïde-onderzoek noodzakelijk maakt. De auteurs suggereren de tabakshoornworm Manduca sexta als een nieuw insectenmodelsysteem. Dit protocol biedt informatie over het voorbereiden van het kunstmatige dieet met verschillende hoeveelheden cannabidiol (CBD), het opzetten van een kweekomgeving en het monitoren van hun fysiologische en gedragsveranderingen als reactie op CBD-behandeling. Kortom, na ontvangst van hoornwormeieren kregen de eieren 1-3 dagen bij 25 °C op een licht-donkercyclus van 12:12 om uit te komen voordat ze willekeurig in de controle werden verdeeld (op tarwekiemen gebaseerd kunstmatig dieet; AD), voertuig (AD + 0,1% middellange keten triglyceride olie; MCT olie) en behandelingsgroepen (AD + 0,1% MCT + 1 mM of 2 mM CBD). Nadat de media waren voorbereid, werden de 1e instarlarven individueel in een reageerbuis van 50 ml geplaatst met een houten spiesstok en vervolgens werd de reageerbuis bedekt met een kaasdoek. Metingen werden genomen in intervallen van 2 dagen voor fysiologische en gedragsmatige reacties op de CBD-toediening. Deze eenvoudige kweekprocedure stelt onderzoekers in staat om grote exemplaren in een bepaald experiment te testen. Bovendien stellen de relatief korte levenscycli onderzoekers in staat om de impact van cannabinoïdebehandelingen over meerdere generaties van een homogene populatie te bestuderen, waardoor gegevens een experimenteel ontwerp in organismen met een hoger zoogdiermodel kunnen ondersteunen.
In de afgelopen jaren is de publieke aandacht gericht op cannabinoïden vanwege hun therapeutisch potentieel, waaronder de behandeling van epilepsie1, de ziekte van Parkinson2, multiple sclerose3 en verschillende vormen van kanker4,5,6 met cannabidiol (CBD). Sinds cannabis is gelegaliseerd als een agrarisch product in de Agricultural Improvement Act van 2018, Public Law 115-334 (de Farm Bill van 2018), zijn cannabis en zijn cannabinoïdederivaten in de voedsel-, cosmetische en farmaceutische industrie exponentieel toegenomen. Daarnaast zijn klinische isolaten van enkelvoudige cannabinoïden en cannabinoïdemengsels met succes getest bij menselijke proefpersonen7, cellijnen5,8 en diverse diermodelsystemen9,10.
Een klinische studie zou ideaal zijn voor het valideren van de werkzaamheid en nadelige effecten van cannabinoïden op een specifieke ziekte. Er zijn echter tal van uitdagingen in klinische onderzoeken, waaronder ethische / IRB-goedkeuring, werving en behoud van de proefpersonen11. Om deze hindernissen te overwinnen, werden verschillende menselijke cellijnen gebruikt omdat van de mens afgeleide cellijnen kosteneffectief zijn, gemakkelijk te hanteren, de ethische kwesties kunnen omzeilen en consistente en reproduceerbare resultaten kunnen opleveren, omdat de cellijnen een ‘zuivere populatie van cellen zijn die geen kruisbesmetting van andere cellen en chemicaliën hebben’12.
Alves et al. (2021)13 testten CBD op een dosisafhankelijke manier in de placentale trofoblasten, gespecialiseerde cellen van de placenta die een essentiële rol spelen bij embryo-implantatie en interactie met de gedecidualiseerde maternale baarmoeder14. Hun resultaten toonden aan dat CBD verlies van levensvatbaarheid van cellen, verstoring van de celcyclusprogressie en apoptose-inductie veroorzaakte. Deze observaties tonen de potentiële negatieve effecten van cannabisgebruik door zwangere vrouwen13. Evenzo werd een reeks cellijnen ook gebruikt om de farmacologische effecten van CBD bij menselijke ziekten te onderzoeken, in het bijzonder verschillende vormen van kanker. De in vitro studies hebben met succes anti-kanker effecten aangetoond in pancreas15, borst8 en colorectale kankercellen16. Hoewel ze op grote schaal beschikbaar en gemakkelijk te hanteren zijn, zijn specifieke cellijnen zoals HeLa, HEK293 gevoelig voor genetische en fenotypische veranderingen als gevolg van veranderingen in hun groeiomstandigheden of hantering17.
In cannabisonderzoek zijn verschillende diermodelsystemen, variërend van kleine dieren zoals muis18, cavia19 en konijn19 tot grote dieren zoals canine20, piglet21, monkey22, horse23, gebruikt om onbekende therapeutische effecten te onderzoeken. Muizen zijn het meest geprefereerde diermodelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek vanwege hun anatomische, fysiologische en genetische gelijkenis met mensen24. Het belangrijkste is dat muizen CB1 / 2-receptoren in hun zenuwstelsel hebben, die aanwezig zijn bij mensen. Ze hebben ook een kortere levenscyclus dan menselijke proefpersonen, met gemakkelijker onderhoud en overvloedige genetische bronnen, waardoor het veel gemakkelijker is om de effecten van cannabinoïden gedurende een hele levenscyclus te volgen. Het zoogdiersysteem wordt veel gebruikt en heeft met succes aangetoond dat CBD epileptische stoornissen1, posttraumatische stressstoornis9, orale zweren25 en dementie-achtige symptomen verlicht10. Het muismodel heeft ook een sociale interactiestudie van individuen binnen een gemeenschap mogelijk gemaakt, wat uiterst moeilijk is bij grote dieren en mensen26.
Ondanks alle voordelen van het diermodelsysteem is het nog steeds duur en vereist het intensieve zorg tijdens de toediening van geneesmiddelen en het verzamelen van gegevens. Bovendien is er onderzoek naar het gebruik van muizen in onderzoek vanwege onherleidbaarheid en slechte recapitulatie van menselijke omstandigheden als gevolg van beperkingen in experimenteel ontwerp en striktheid27.
Met de toenemende vraag naar medische/preklinische studies van cannabinoïden, is een niet-zoogdiermodelsysteem nodig. Ongewervelde modellen verleenden traditioneel onderscheidende voordelen ten opzichte van gewervelde modellen. De belangrijke voordelen zijn onder meer het gemak en de lage kosten van het fokken van veel exemplaren en het in staat stellen van onderzoekers om meerdere generaties genetisch homogene populaties te volgen28. Een recente studie bewees dat de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, een effectief insectenmodelsysteem is om farmacologische functies van cannabinoïden te onderzoeken bij het moduleren van voedingsgedrag29. Onder de insectenmodelsystemen concentreerden de auteurs zich op de tabakshoornworm, Manduca sexta, ook bekend als Carolina-sfinxmot of haviksmot, als een nieuw insectenmodelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek.
Manduca sexta behoort tot de familie van de pijlstaarten . Het insect is de meest voorkomende plantenplaag in het zuiden van de Verenigde Staten, waar ze zich voeden met solanaceous planten. Het insectenmodel heeft een lange geschiedenis in onderzoek in insectenfysiologie, biochemie, neurobiologie en geneesmiddelinteractiestudies. Manduca sexta’s onderzoeksportfolio omvat een concept-genoomsequentie, waardoor een begrip op moleculair niveau van essentiële cellulaire processen mogelijk is30. Een ander cruciaal voordeel van dit modelsysteem is de grote omvang, die meer dan 100 mm lang en 10 g in gewicht bereikt in de 18-25 dagen van larvale ontwikkeling. De grote omvang stelt onderzoekers in staat om morfologische en gedragsveranderingen in realtime te volgen als reactie op de CBD-behandeling. Ook werden vanwege de grootte elektrofysiologische reacties onderzocht met het abdominale zenuwstelsel, inclusief ganglia ontleed uit de larven zonder hoge resolutie microscoopinstellingen. Het unieke kenmerk stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk acute en langetermijnreacties op de toegediende cannabinoïde (s) te onderzoeken.
Ondanks deze veelzijdigheid is M. sexta pas onlangs onderzocht op zijn geschiktheid als experimenteel model voor cannabis- en cannabinoïdestudies. In 2019 gebruikten de auteurs voor het eerst het insectenmodelsysteem om de hypothese aan te pakken dat cannabis is geëvolueerd om Cannabidiol te produceren om zichzelf te beschermen tegen insectenbivoor30,31. Het resultaat toonde duidelijk aan dat de planten CBD gebruikten als een voedingsafschrikmiddel en de groei van het plaaginsect M. sexta-rups remden, en ook een verhoogde mortaliteit veroorzaakten31. De studie toonde ook de reddende effecten van CBD op bedwelmde ethanollarven aan, waardoor het potentiële voertuigeffect van ethanol als drager van de CBD werd geïdentificeerd. Zoals getoond, onderzocht het insectenmodelsysteem effectief de therapeutische effecten van cannabinoïden binnen 3-4 weken met minder arbeid en kosten dan andere dierlijke systemen. Hoewel het insectenmodel cannabinoïdereceptoren mist (d.w.z. geen CB1/2-receptoren), biedt het modelsysteem een waardevol hulpmiddel om de farmacologische rollen van cannabinoïden te begrijpen via een cannabinoïdereceptoronafhankelijke manier.
De auteurs van deze studie hebben eerder gewerkt met de tabakshoornworm als een modelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek31. Na zorgvuldige afweging van de voordelen en risico’s van het gebruik van M. sexta, hebben we een methode verstrekt met de juiste verzorging en voorbereiding van het dieet voor preklinische onderzoeken die mogelijkheden bieden voor toekomstig preklinisch laboratoriumgebruik.
De voedingsstudie toonde aan dat hoge doses CBD (2 mM) de groei van het insect remden en de mortaliteit verhoogden31. Het insectenmodel toonde ook gevoeligheid voor ethanol; CBD ontgifte echter effectief de ethanoltoxiciteit, waardoor hun overlevingskans, dieetconsumptie en voedselzoekgedrag tot vergelijkbare niveaus als de controlegroep werden verhoogd (figuur 3A, B) 31. Het beschreven insectenmodelsysteem bestaat uit drie kri…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door het Institute of Cannabis Research van de Colorado State University-Pueblo en het ministerie van Wetenschap en ICT (2021-DD-UP-0379) en Chuncheon city (Hennep R & D en industrialisatie, 2020-2021).
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |