カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワーム

Summary

本プロトコルはカンナビノイド研究でタバコホーンワーム ・カンドゥカ・セクスタ を使用するための教育情報を提供する。 ここで説明する方法には、カンナビジオール(CBD)治療に応答して昆虫モデルの生理学的および行動変化を監視するために必要なすべての供給およびプロトコルが含まれる。

Abstract

薬のカンナビノイドに対する注目が高まる中、いくつかの哺乳類モデル生物が未知の医薬品機能を解明するために使用されてきた。しかし、哺乳類の研究には多くの困難が残っており、カンナビノイド研究のために非哺乳類モデル生物の開発が必要です。著者らは、タバコの角虫 マドゥカ・セクスタ を新しい昆虫モデルシステムとして示唆している。このプロトコルは、様々な量のカンナビジオール(CBD)で人工食事を準備し、栽培環境を設定し、CBD治療に応じてそれらの生理学的および行動変化を監視する上での情報を提供する。簡単に言えば、ホーンワームの卵を受け取ると、卵は12:12の明暗サイクルで25°Cで1〜3日間孵化させ、無作為に制御に分配される(小麦胚芽ベースの人工食。AD)、車両(AD + 0.1%中鎖トリグリセリドオイル;MCTオイル)および処置群(AD + 0.1% MCT + 1 mMまたはCBDの2 mM)。培地が準備されると、^1番目 のインスター幼虫を木製の串刺しで50mLの試験管に個別に入れ、その後、試験管をチーズクロスで覆った。測定は、CBD投与に対する生理学的および行動的応答に対して2日間間隔で測定した。この簡単な栽培手順により、研究者は特定の実験で大きな標本をテストすることができます。さらに、比較的短いライフサイクルにより、研究者は同種集団の複数世代にわたるカンナビノイド治療の影響を研究することができ、より高い哺乳類モデル生物における実験計画をサポートするデータを可能にする。

Introduction

過去数年間、てんかん¹、パーキンソン病²、多発性硬化症³、カンナビジオール(CBD)を有する癌^の様々な形態を含む、治療の可能性のためにカンナビノイ^ドに注目が集まりてきました。 大麻は2018年の農業改善法で農産物として合法化されているため、公法115-334(2018ファーム法案)、大麻およびその食品、化粧品、製薬業界におけるカンナビノイド誘導体が指数関数的に増加しています。さらに、単一のカンナビノイドおよびカンナビノイド混合物の臨床グレードの分離株は、ヒト被験者⁷、細胞株^5、8、および多様な動物モデルシステム^9,10で試験に成功した。

臨床試験は、特定の疾患に対するカンナビノイドの有効性および副作用を検証するのに理想的であろう。しかし、臨床試験には、倫理的/IRBの承認、採用、および被験者¹¹の保持を含む多くの課題があります。これらのハードルを克服するために、人間由来の細胞株は費用対効果が高く、取り扱いやすく、倫理的な問題を回避し、細胞株が他の細胞や化学物質の交差汚染を持たない細胞の純粋な集団であるため、様々なヒト細胞株が使用^{されました。}

Alves et al. (2021)¹³ は、胚移植および脱卵性母体子宮との相互作用に不可欠な役割を果たす胎盤の特殊な細胞である胎盤栄養芽細胞において用量依存的な方法でCBDを試験^した。その結果、CBDは細胞生存率の低下、細胞周期進行の中断、アポトーシス誘導を引き起こした。これらの観察は、妊娠中の女性による 大麻 使用の潜在的な負の影響^を示す13。同様に、一連の細胞株はまた、ヒト疾患、特に様々な形態の癌におけるCBDの薬理学的効果を調べるためにも使用された。 インビトロ 研究は、膵臓¹⁵、乳房⁸、および大腸癌細胞¹⁶における抗癌効果を実証した。しかし、広く利用可能で扱いやすい一方で、HeLa、HEK293などの特定の細胞株は、その成長条件の変化または取り扱い¹⁷による遺伝的および表現型の変化を起こしやすい。

カンナビス研究では、^mouse18、モルモット¹⁹、ウサギ19などの小動物から、イニヌ20、ピグレット²¹、^monkey22、^horse23などの大型動物に至るまで、さまざまな動物モデルシステムが未知の治療効果を探求するために使用されてきた。マウスは、解剖学的、生理学的、および遺伝的類似性から、カンナビノイド研究において最も好ましい動物モデルシステムである^。最も重要なことは、マウスはヒトに存在する神経系にCB1/2受容体を有する。彼らはまた、人間の被験者よりも短いライフサイクルを持ち、メンテナンスが容易で豊富な遺伝資源を持ち、ライフサイクル全体を通してカンナビノイドの影響を監視することがはるかに容易になります。哺乳動物系は広く使用されており、CBDが発作障害¹、心的外傷後ストレス障害⁹、口腔潰瘍²⁵、および認知症様症状¹⁰を緩和することを実証した。マウスモデルはまた、大規模な動物やヒト²⁶では非常に困難であるコミュニティ内の個人の社会的相互作用研究を可能にしました。

動物モデルシステムのすべての利点にもかかわらず、それはまだ高価であり、薬物投与とデータ収集中に集中治療を必要とします。さらに、実験計画や^rigor27の制限により、再現性が悪く、人間の状態の再現性が悪いため、研究にマウスを使用する精査があります。

カンナビノイドの医療/前臨床試験の需要が高まっていると、非哺乳類モデルシステムが必要です。無脊椎動物モデルは、伝統的に脊椎動物モデルよりも独特の利点を与えました。重要な利点は、多くの標本を飼育し、研究者が遺伝的に均質な集団の複数の世代を監視することを可能にする容易さと低コストが含まれます²⁸。最近の研究では、フルーツフライ、 ショウジョウバエメラノガスターは、 摂食行動を調節するカンナビノイドの薬理学的機能を調査するための効果的な昆虫モデルシステムであることが証明されました²⁹。昆虫モデルシステムの中で、著者らはカンナビノイド研究のための新しい昆虫モデルシステムとして、タバコの角虫、 マドゥカ・セクスタ(カロライナ・スフィンクス・ガまたはタカガとも呼ばれる)に焦点を当てた。

マドゥカ・セクスタ はスフィンヒダ科の家族のものです。昆虫は、彼らがソラナス植物を食べる米国南部で最も一般的な植物害虫です。昆虫モデルは、昆虫生理学、生化学、神経生物学、薬物相互作用研究の研究に長い歴史を持っています。 Manduca sextaの研究ポートフォリオには、ゲノム配列の草案が含まれており、本質的な細胞プロセス³⁰の分子レベルの理解を可能にする。このモデルシステムのもう一つの重要な利点は、幼虫の開発の18-25日で長さが100ミリメートル以上、重量が10g以上に達する、その大きなサイズです。大きいサイズは研究者が容易にCBDの処置に応じてリアルタイムで形態学的および行動の変化を監視することを可能にする。また、サイズに起因して、高解像顕微鏡設定なしで幼虫から解剖された神経節を含む、腹部神経系で電気生理学的応答を検査した。ユニークな機能により、研究者は投与されたカンナビノイドに対する急性および長期的な反応を容易に調査することができます。

このような汎用性にもかかわらず、M.sextaは最近、大麻およびカンナビノイド研究の実験モデルとしての適合性について検討されました。2019年、著者らは、カンナビスが昆虫草食動物^30,31から身を守るためにカンナビジオールを産生するように進化したという仮説に初めて対処するために、昆虫モデルシステムを使用しました。その結果、植物が摂食抑止力としてCBDを利用し、害虫昆虫M.sexta毛虫の成長を阻害し、死亡率³¹の増加を引き起こしたことが明らかになった。この研究はまた、CBDのキャリアとしてエタノールの潜在的な車両効果を同定し、中毒エタノール幼虫に対するCBDの救出効果を実証した。示されるように、昆虫モデルシステムは、他の動物システムよりも少ない人数とコストで3〜4週間以内にカンナビノイドの治療効果を効果的に調査した。昆虫モデルはカンナビノイド受容体(すなわち、CB1/2受容体なし)を欠いているが、モデルシステムはカンナビノイド受容体非依存的な方法を通してカンナビノイドの薬理学的役割を理解するための貴重なツールを提供する。

この研究の著者は、以前にカンナビノイド研究³¹のモデルシステムとしてタバコホーンワームと協力してきました。 M.sextaを使用する利点とリスクを慎重に検討した結果、将来の前臨床検査室での使用の機会を可能にする前臨床試験のための食事の適切なケアと準備を含む方法を提供しました。

Protocol

1. ホーンワームの準備とカンナビジオールの治療 150-200実行可能な Mを得る。 セクスタ 卵と小麦胚芽ベースの人工食( 資料表を参照)。 ホーンワームの卵を小麦胚芽ベースの人工食(AD)層を持つポリスチレンペトリ皿に入れ、40%〜60%の相対湿度で25°Cに維持された昆虫飼育室( 材料表を参照)に卵を移します。 タバコの角?…

Representative Results

カンナビノイド毒性を調べるモデルシステムとしてのカンドゥカ・セクスタ図1 は、タバコホーンワーム ・マドゥカ・セクスタを用いたCBD実験の主要成分を示しています。多数の昆虫(>20)を12時間:12時間=明るい:暗循環で25°Cで個別に飼育した。昆虫の大きさ、重量、死亡率を2日間間隔で測定し、高用量CBD(2mM)治療後の短期およ?…

Discussion

摂食研究は、CBDの高用量(2 mM)が昆虫の成長を阻害し、死亡率を増加させたことを実証^した31。昆虫モデルはまた、エタノールに対する感受性を示した。しかし、CBDはエタノール毒性を効果的に解毒し、その生存率、食事消費、および食物探索行動を対照群と同様のレベルまで増加させた(図3A、B)³¹。説明された昆虫モデル?…

Materials

Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50