Tobakkshornorm som insektmodellsystem for cannabinoid prekliniske studier

Summary

Den nåværende protokollen gir instruksjonsinformasjon for bruk av tobakk hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Metoden som er beskrevet her inkluderer alle nødvendige forsyninger og protokoller for å overvåke fysiologiske og atferdsmessige endringer i insektmodellen som svar på cannabidiol (CBD) behandling.

Abstract

Med økt oppmerksomhet på cannabinoider i medisin, har flere pattedyrmodellorganismer blitt brukt til å belyse sine ukjente farmasøytiske funksjoner. Imidlertid forblir mange vanskeligheter i pattedyrforskning, noe som nødvendiggjør utviklingen av ikke-pattedyrmodellorganismer for cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobakk hornworm Manduca sexta som et nytt insektmodellsystem. Denne protokollen gir informasjon om å forberede det kunstige kostholdet med varierende mengder cannabidiol (CBD), sette opp et dyrkingsmiljø og overvåke deres fysiologiske og atferdsmessige endringer som svar på CBD-behandling. Kort sagt, etter å ha mottatt hornormegg, ble eggene tillatt 1-3 dager ved 25 °C på en 12:12 lys mørk syklus for å klekkes før de ble tilfeldig fordelt i kontroll (hvetekimbasert kunstig diett; AD), kjøretøy (AD + 0,1% mellomkjedet triglyseridolje; MCT-olje) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når media var forberedt, ble ^{første instar} larver individuelt plassert i et 50 ml reagensrør med en trespydpinne, og deretter ble reagensrøret dekket med en osteklut. Målinger ble tatt i 2-dagers intervaller for fysiologiske og atferdsmessige responser på CBD-administrasjonen. Denne enkle dyrkingsprosedyren gjør det mulig for forskere å teste store prøver i et gitt eksperiment. I tillegg gjør de relativt korte livssyklusene det mulig for forskere å studere effekten av cannabinoidbehandlinger over flere generasjoner av en homogen befolkning, slik at data kan støtte en eksperimentell design i høyere pattedyrmodellorganismer.

Introduction

I løpet av de siste årene har offentlig oppmerksomhet vært sentrert om cannabinoider på grunn av deres terapeutiske potensial, inkludert behandling av epilepsi1, Parkinsons ^sykdom2, multippel sklerose3 og ulike former for kreft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Siden Cannabis er legalisert som en landbruksvare i landbruksforbedringsloven av 2018, har offentlig lov 115-334 (2018 Farm Bill), Cannabis og dens cannabinoidderivater i næringsmiddel-, kosmetikk- og farmasøytisk industri eksponentielt økt. I tillegg har kliniske isolasjoner av enkeltkannabinoider og cannabinoidblandinger blitt testet med hell hos ^mennesker7, ^{cellelinjer5,8} og forskjellige dyremodellsystemer9,10.

En klinisk studie vil være ideell for validering av effekt og bivirkninger av cannabinoider på en bestemt sykdom. Det er imidlertid mange utfordringer i kliniske studier, inkludert etisk/IRB-godkjenning, rekruttering og oppbevaring av ^fagene11. For å overvinne disse hindringene ble ulike menneskelige cellelinjer brukt fordi menneskeavledede cellelinjer er kostnadseffektive, enkle å håndtere, kan omgå de etiske problemene og gi konsistente og reproduserbare resultater da cellelinjene er en ‘ren populasjon av celler som ikke har krysskontaminering av andre celler og ^{kjemikalier’12}.

Alves et al. (2021)¹³ testet CBD på en doseavhengig måte i placental trophoblasts, som er spesialiserte celler i morkaken som spiller en viktig rolle i embryoimplantasjon og interaksjon med den decidualiserte mors ^livmor14. Resultatene deres viste at CBD forårsaket tap av celle levedyktighet, forstyrrelser i cellesyklusprogresjon og apoptoseinduksjon. Disse observasjonene viser de potensielle negative virkningene av cannabisbruk av gravide ^kvinner13. På samme måte ble en rekke cellelinjer også brukt til å undersøke de farmakologiske effektene av CBD i menneskelige sykdommer, spesielt ulike former for kreft. In vitro-studiene viste vellykket antikrefteffekter i bukspyttkjertelen15, ^bryst8 og kolorektal ^{kreftceller16}. Men mens de er allment tilgjengelige og enkle å håndtere, er spesifikke cellelinjer som HeLa, HEK293 utsatt for genetiske og fenotypiske endringer på grunn av endringer i vekstforholdene eller ^{håndteringen17}.

I cannabisforskning har ulike dyremodellsystemer, alt fra små dyr som ^mus18, ^marsvin19 og ^kanin19 til store dyr som ^hunde20, ^piglet21, ^monkey22, ^horse23, blitt brukt til å utforske ukjente terapeutiske effekter. Mus har vært det mest foretrukne dyremodellsystemet for cannabinoidforskning på grunn av deres anatomiske, fysiologiske og genetiske likhet med ^mennesker24. Mest signifikant har mus CB1/2 reseptorer i nervesystemet, som er tilstede hos mennesker. De har også en kortere livssyklus enn mennesker, med enklere vedlikehold og rikelig genetiske ressurser, og dermed gjør det mye lettere å overvåke effekten av cannabinoider gjennom en hel livssyklus. Pattedyrsystemet er mye brukt og har med hell vist at CBD lindrer anfallsforstyrrelser1, posttraumatisk stresslidelse9, orale ^sår25 og demenslignende ^symptomer10. Musemodellen har også gjort det mulig å studere individer i et samfunn som er ekstremt vanskelig hos store dyr og ^mennesker26.

Til tross for alle fordelene med dyremodellsystemet, er det fortsatt kostbart og krever intensivbehandling under legemiddeladministrasjon og datainnsamling. I tillegg er det granskning av bruk av mus i forskning på grunn av irreproducibility og dårlig recapitulation av menneskelige forhold på grunn av begrensninger i eksperimentell design og ^rigor27.

Med den økende etterspørselen etter medisinske / prekliniske studier av cannabinoider, er det nødvendig med et ikke-pattedyrmodellsystem. Hvirvelløse modeller ga tradisjonelt særegne fordeler i forhold til virveldyrmodeller. De betydelige fordelene inkluderer enkelhet og lave kostnader ved å oppdra mange prøver og gjøre det mulig for forskere å overvåke flere generasjoner genetisk homogene ^{populasjoner28}. En nylig studie viste at fruktfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodellsystem for å undersøke farmakologiske funksjoner av cannabinoider i modulerende fôringsatferd29. Blant insektmodellsystemene fokuserte forfatterne på tobakkshornorm, Manduca sexta, også kjent som Carolina sfinxmot eller haukmot, som et nytt insektmodellsystem for cannabinoidforskning.

Manduca sexta tilhører familien til Sphingidae. Insektet er det vanligste plante i det sørlige USA, hvor de spiser på solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie i forskning innen insektfysiologi, biokjemi, nevrobiologi og legemiddelinteraksjonsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje inkluderer et utkast til genomsekvens, noe som gir en molekylær forståelse av essensielle cellulære ^prosesser30. En annen avgjørende fordel med dette modellsystemet er dens store størrelse, og når mer enn 100 mm i lengde og 10 g i vekt i 18-25 dager med larvutvikling. Den store størrelsen gjør det mulig for forskere å enkelt overvåke morfologiske og atferdsmessige endringer i sanntid som svar på CBD-behandlingen. Også på grunn av størrelsen ble elektrofysiologiske responser undersøkt med buknervesystemet, inkludert ganglia dissekert fra larver uten høyoppløselige mikroskopinnstillinger. Den unike funksjonen gjør det mulig for forskere å lett undersøke akutte og langsiktige svar på administrerte cannabinoid(er).

Til tross for en slik allsidighet har M. sexta bare nylig blitt utforsket for sin egnethet som en eksperimentell modell for Cannabis– og cannabinoidstudier. I 2019 brukte forfatterne insektmodellsystemet for første gang for å adressere hypotesen om at Cannabis har utviklet seg til å produsere Cannabidiol for å beskytte seg mot insekt plantelevende ^dyr30,31. Resultatet viste tydelig at plantene utnyttet CBD som en fôring avskrekkende og hemmet veksten av skadedyrsinsektet M. sexta caterpillar, samt forårsaker økt ^{dødelighet31}. Studien demonstrerte også de reddende effektene av CBD til berusede etanollarver, og identifiserte den potensielle kjøretøyeffekten av etanol som bærer av CBD. Som vist undersøkte insektmodellsystemet effektivt de terapeutiske effektene av cannabinoider innen 3-4 uker med mindre arbeidskraft og kostnader enn andre dyresystemer. Selv om insektmodellen mangler cannabinoidreseptorer (dvs. ingen CB1/2-reseptorer), gir modellsystemet et verdifullt verktøy for å forstå de farmakologiske rollene til cannabinoider gjennom en cannabinoidreseptoruavhengig måte.

Forfatterne av denne studien har tidligere jobbet med tobakkshornorm som modellsystem for cannabinoidforskning31. Etter nøye vurdering av fordelene og risikoen ved å bruke M. sexta, har vi gitt en metode som involverer riktig omsorg og forberedelse av diett for prekliniske studier som gir muligheter for fremtidig preklinisk laboratoriebruk.

Protocol

1. Hornworm forberedelse og cannabidiol behandling Oppnå 150-200 levedyktig M. sexta egg og hvete bakteriebaserte kunstige dietter (se Tabell over materialer). Legg hornormeggene i en polystyren Petri-tallerken med et hvetekimbasert kunstig kosthold (AD) lag og overfør eggene til et insektoppdrettskammer (se Materialbord) opprettholdt ved 25 °C med 40%-60% relativ fuktighet. La tobakk hornworm egg i 1-3 dager å klekke i…

Representative Results

Manduca sexta som modellsystem for å undersøke cannabinoider toksisitetFigur 1 viser nøkkelkomponentene i CBD-eksperimentet ved hjelp av tobakkhornorm Manduca sexta. Et stort antall insekter (>20) ble individuelt oppdrettet ved 25 °C på en 12 t:12 t = lys: mørk syklus. Insektenes størrelse, vekt og dødelighet ble målt med 2-dagers intervaller for å overvåke for kort- og langtidsresponser etter høydose CBD (2 mM) behandling.<…

Discussion

Fôringsstudien viste at høye doser CBD (2 mM) hemmet insektets vekst og økt ^{dødelighet31}. Insektmodellen viste også følsomhet for etanol; CBD avgiftet imidlertid effektivt etanoltoksisiteten, og økte overlevelsesraten, diettforbruket og matsøkeatferden til lignende nivåer som kontrollgruppen (figur 3A, B)³¹. Det beskrevne insektmodellsystemet består av tre kritiske trinn: (1) sikre at M. sextas egg klekkes je…

Materials

Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50