Mevcut protokol, kannabinoid araştırmalarında tütün boynuz kurdu Manduca sexta’yı kullanmak için eğitici bilgiler sağlar. Burada açıklanan yöntem, kannabidiol (CBD) tedavisine yanıt olarak böcek modelinin fizyolojik ve davranışsal değişikliklerini izlemek için gerekli tüm malzemeleri ve protokolleri içerir.
Tıpta kannabinoidlere daha fazla dikkat çekmekle, bilinmeyen farmasötik işlevlerini aydınlatmak için birkaç memeli model organizma kullanılmıştır. Bununla birlikte, kannabinoid araştırmaları için memeli olmayan model organizmaların geliştirilmesini gerektiren memeli araştırmalarında birçok zorluk devam etmektedir. Yazarlar tütün boynuz kurdu Manduca sexta’yı yeni bir böcek modeli sistemi olarak önermektedir. Bu protokol, yapay diyetin çeşitli miktarlarda kannabidiol (CBD) ile hazırlanması, bir yetiştirme ortamı kurulması ve CBD tedavisine yanıt olarak fizyolojik ve davranışsal değişikliklerinin izlenmesi hakkında bilgi sağlar. Kısaca, boynuz kurdu yumurtaları aldıktan sonra, yumurtaların kontrole rastgele dağıtılmadan önce 12:12 açık-karanlık bir döngüde 25 ° C’de 1-3 gün yumurtadan çıkmasına izin verildi (buğday tohumu bazlı yapay diyet; AD), araç (AD + % 0.1 orta zincirli trigliserit yağı; MCT yağı) ve tedavi grupları (AD + %0,1 MCT + 1 mM veya 2 mM CBD). Ortam hazırlandıktan sonra, 1. MİA yönetimine fizyolojik ve davranışsal yanıtlar için 2 günlük aralıklarla ölçümler yapıldı. Bu basit yetiştirme prosedürü, araştırmacıların belirli bir deneyde büyük örnekleri test etmelerini sağlar. Ek olarak, nispeten kısa yaşam döngüleri, araştırmacıların kannabinoid tedavilerinin homojen bir popülasyonun birden fazla nesli üzerindeki etkisini incelemelerini sağlayarak, verilerin daha yüksek memeli model organizmalarda deneysel bir tasarımı desteklemesine izin verir.
Son yıllarda, epilepsi1, Parkinson hastalığı2, multipl skleroz3 ve kannabidiol (CBD) ile çeşitli kanser formları da dahil olmak üzere terapötik potansiyelleri nedeniyle halkın ilgisi kannabinoidlere odaklanmıştır. Esrar, 2018 yılı Tarımsal İyileştirme Yasası’nda tarımsal bir mal olarak yasal hale getir edildiğinden, 115-334 sayılı Kamu Kanunu (2018 Çiftlik Yasa Tasarısı), Esrar ve gıda, kozmetik ve ilaç endüstrilerindeki kannabinoid türevleri katlanarak artmıştır. Ek olarak, tek kannabinoidlerin ve kannabinoid karışımlarının klinik sınıf izoleleri insan deneklerde başarıyla test edilmiştir7, hücre hatları5,8 ve çeşitli hayvan modeli sistemleri9,10.
Klinik bir çalışma, kannabinoidlerin belirli bir hastalık üzerindeki etkinliğini ve olumsuz etkilerini doğrulamak için ideal olacaktır. Bununla birlikte, klinik çalışmalarda etik / IRB onayı, işe alım ve konuların tutulması dahil olmak üzere çok sayıda zorluk vardır11. Bu engelleri aşmak için, insan kaynaklı hücre hatları uygun maliyetli, kullanımı kolay, etik sorunları atlayabilen ve hücre hatları ‘diğer hücrelerin ve kimyasalların çapraz kontaminasyonu olmayan saf bir hücre popülasyonu’ olduğu için tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabildiği için çeşitli insan hücre hatları kullanılmıştır 12.
Alves ve ark. (2021)13, embriyo implantasyonunda ve desidualize anne uterus ile etkileşimde önemli bir rol oynayan plasetanın özel hücreleri olan plasetal trofoplastlarda cbd’yi doza bağımlı bir şekilde test etti14. Sonuçları CBD’nin hücre canlılığı kaybına, hücre döngüsü ilerleme bozulmasına ve apoptoz indüksiyona neden olduğunu göstermiştir. Bu gözlemler hamile kadınlar tarafından Esrar kullanımının potansiyel olumsuz etkilerini göstermektedir13. Aynı şekilde, CBD’nin insan hastalıklarındaki farmakolojik etkilerini, özellikle de çeşitli kanser türlerini incelemek için bir dizi hücre hattı da kullanılmıştır. Tüp bebek çalışmaları pankreas15, meme8 ve kolorektal kanser hücrelerinde kanser önleyici etkileri başarıyla göstermiştir16. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılabilir ve kullanımı kolay olmakla birlikte, HeLa, HEK293 gibi belirli hücre hatları, büyüme koşullarındaki veya elleçlemelerindeki değişiklikler nedeniyle genetik ve fenotipik değişikliklere eğilimlidir17.
Esrar araştırmalarında, fare18, kobay19 ve tavşan19 gibi küçük hayvanlardan köpek20, piglet21, monkey22, horse23 gibi büyük hayvanlara kadar çeşitli hayvan modeli sistemleri bilinmeyen terapötik etkileri araştırmak için kullanılmıştır. Fareler anatomik, fizyolojik ve genetik olarak insanlara olan benzerlikleri nedeniyle kannabinoid araştırmaları için en çok tercih edilen hayvan modeli sistemi olmuştur24. En önemlisi, farelerin sinir sisteminde insanlarda bulunan CB1/2 reseptörleri vardır. Ayrıca, daha kolay bakım ve bol miktarda genetik kaynaklarla insan deneklerden daha kısa bir yaşam döngüsüne sahiptirler, böylece tüm yaşam döngüsü boyunca kannabinoidlerin etkilerini izlemeyi çok daha kolay hale getirirler. Memeli sistemi yaygın olarak kullanılmaktadır ve CBD’nin nöbet bozukluklarını hafiflettiği başarıyla gösterilmiştir1, travma sonrası stres bozukluğu9, oral ülser25 ve demans benzeri semptomlar10. Fare modeli ayrıca büyük hayvanlarda ve insanlarda son derece zor olan bir topluluk içindeki bireylerin sosyal etkileşim çalışmasını sağlamıştır26.
Hayvan modeli sisteminin tüm avantajlarına rağmen, ilaç yönetimi ve veri toplama sırasında hala maliyetlidir ve yoğun bakım gerektirir. Ek olarak, deneysel tasarım ve titizlikteki sınırlamalar nedeniyle insan koşullarının geri alınamazlığı ve zayıf rekapitülasyonu nedeniyle araştırmalarda farelerin kullanılması incelanmaktadır27.
Kannabinoidlerin tıbbi/preklinik çalışmalarına artan taleple birlikte memeli olmayan bir model sistemine ihtiyaç duyulmaktadır. Omurgasız modeller geleneksel olarak omurgalı modellere göre farklı faydalar sağlar. Önemli faydalar arasında birçok örneği yetiştirme kolaylığı ve düşük maliyeti ve araştırmacıların genetik olarak homojen popülasyonların birden fazla neslini izlemelerini sağlamak28 sayılacaktır. Yeni bir çalışma, meyve sineği Drosophila melanogaster’ın, beslenme davranışlarını modüle etmede kannabinoidlerin farmakolojik işlevlerini araştırmak için etkili bir böcek modeli sistemi olduğunu kanıtladı29. Böcek modeli sistemleri arasında, yazarlar tütün boynuz kurdu, Carolina sfenks güvesi veya şahin güvesi olarak da bilinen Manduca sexta’ya kannabinoid araştırmaları için yeni bir böcek modeli sistemi olarak odaklandılar.
Manduca sexta Sphingidae ailesine aittir. Böcek, solanaceous bitkilerle beslendikleri güney Amerika Birleşik Devletleri’ndeki en yaygın bitki zararlısıdır. Böcek modeli, böcek fizyolojisi, biyokimya, nörobiyoloji ve ilaç etkileşimi çalışmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Manduca sexta’nın araştırma portföyü, temel hücresel süreçlerin moleküler düzeyde anlaşılmasını sağlayan bir taslak genom dizisi içerir30. Bu model sisteminin bir diğer önemli faydası, 18-25 günlük larva gelişiminde 100 mm’den uzunluğa ve 10 g ağırlığa ulaşan büyük boyutudur. Büyük boyut, araştırmacıların CBD tedavisine yanıt olarak morfolojik ve davranışsal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kolayca izlemelerini sağlar. Ayrıca, büyüklüğü nedeniyle, yüksek çözünürlüklü mikroskop ayarları olmadan larvalardan incelenen gangliyonlar da dahil olmak üzere karın sinir sistemi ile elektrofizyolojik yanıtlar incelendi. Benzersiz özellik, araştırmacıların uygulanan kannabinoidlere akut ve uzun vadeli yanıtları kolayca araştırmalarını sağlar.
Bu kadar çok yönlü olmasına rağmen, M. sexta esrar ve kannabinoid çalışmaları için deneysel bir model olarak uygunluğu için sadece son zamanlarda araştırılmıştır. 2019’da yazarlar, Esrar’ın böcek otçullarından korunmak için Kannabidiol üretmek için evrimleştiği hipotezini ele almak için ilk kez böcek modeli sistemini kullandılar30,31. Sonuç, bitkilerin CBD’yi bir beslenme caydırıcısı olarak sömürdüğünü ve haşere böceği M. sexta tırtılının büyümesini engellediğini ve mortalitenin artmasına neden olduğunu açıkça göstermiştir31. Çalışma ayrıca CBD’nin sarhoş etanol larvalarına olan kurtarılma etkilerini göstererek, CBD taşıyıcısı olarak etanolün potansiyel araç etkisini tanımladı. Gösterildiği gibi, böcek modeli sistemi, diğer hayvan sistemlerine göre daha az işçilik ve maliyetle 3-4 hafta içinde kannabinoidlerin terapötik etkilerini etkili bir şekilde araştırdı. Böcek modeli kannabinoid reseptörlerinden yoksun olsa da (yani CB1/2 reseptörleri yoktur), model sistemi kannabinoid reseptörden bağımsız bir şekilde kannabinoidlerin farmakolojik rollerini anlamak için değerli bir araç sağlar.
Bu çalışmanın yazarları daha önce tütün boynuz kurdu ile kannabinoid araştırmaları için bir model sistemi olarak çalışmışlardır31. M. sexta kullanmanın yararları ve riskleri dikkatlice göz önünde bulundurulduktan sonra, gelecekteki preklinik laboratuvar kullanımı için fırsatlar sağlayan preklinik denemeler için diyetin uygun bakımı ve hazırlanmasını içeren bir yöntem sağladık.
Beslenme çalışması, yüksek dozda CBD’nin (2 mM) böceğin büyümesini engellediğini ve mortaliteyi artırdığını göstermiştir31. Böcek modeli de etanol hassasiyeti gösterdi; bununla birlikte, CBD etkili bir şekilde etanol toksisitesini detokse etti, hayatta kalma oranını, diyet tüketimini ve yiyecek arama davranışlarını kontrol grubuna benzer seviyelere yükseltti (Şekil 3A,B)31. Açıklanan böcek modeli…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo Esrar Araştırma Enstitüsü ve Bilim ve Bİt Bakanlığı (2021-DD-UP-0379) ve Chuncheon şehri (Kenevir Ar-Ge ve sanayileşme, 2020-2021) tarafından desteklenmiştir.
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |