Generasjon av null mutanter for å belyse rollen som bakterielle glykosyltransferaser i bakteriell bevegelighet

Summary

Her beskriver vi byggingen av nullmutanter av Aeromonas i spesifikke glykosyltransferaser eller regioner som inneholder glykosyltransferaser, motilitetsanalysene og flagellarensing utført for å etablere involvering og funksjon av deres kodede enzymer i biosyntesen til en glykan, samt rollen til denne glykanen i bakteriell patogenese.

Abstract

Studien av glykosylering i prokaryoter er et raskt voksende område. Bakterier har forskjellige glykosylerte strukturer på overflaten hvis glykaner utgjør en belastningsspesifikk strekkode. De tilhørende glykanene viser høyere mangfold i sukkersammensetning og struktur enn for eukaryoter og er viktige i bakteriell-vert anerkjennelsesprosesser og interaksjon med miljøet. I patogene bakterier har glykoproteiner vært involvert i ulike stadier av den smittsomme prosessen, og glykanmodifikasjoner kan forstyrre spesifikke funksjoner av glykoproteiner. Til tross for fremskrittene i forståelsen av glykansk sammensetning, struktur og biosynteseveier, forblir forståelsen av glykoproteinenes rolle i patogenisitet eller interaksjon med miljøet svært begrenset. Videre, i noen bakterier, deles enzymene som kreves for proteinglykosylering med andre polysakkaridbiosyntetiske veier, som lipopolysakkarid og kapselbiosyntetiske veier. Den funksjonelle betydningen av glykosylering har blitt belyst i flere bakterier gjennom mutasjon av spesifikke gener som antas å være involvert i glykosyleringsprosessen og studien av dens innvirkning på uttrykket av målglykoproteinet og modifiserende glykan. Mesofile Aeromonas har en enkelt og O-glykosylert polar flagellum. Flagellar glykaner viser mangfold i karbohydratsammensetning og kjedelengde mellom Aeromonas stammer. Imidlertid viser alle stammer analysert til dags dato et pseudaminsyrederivat som koblingssukkeret som endrer serin- eller treoninrester. Pseudaminsyrederivatet er nødvendig for polar flagellamontering, og tapet har innvirkning på vedheft, biofilmdannelse og kolonisering. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen beskriver hvordan bygging av nullmutanter kan brukes til å forstå involvering av gener eller genomregioner som inneholder putative glykosyltransferaser i biosyntesen til en flagellar glykan. Dette inkluderer potensialet til å forstå funksjonen til glykosyltransferaser involvert og glykanens rolle. Dette oppnås ved å sammenligne glykanmangelmutanten med villtypestammen.

Introduction

Proteinglykosylering er beskrevet i både Gram-positive og Gram-negative bakterier og består av kovalent vedlegg av en glykan til en aminosyre sidekjede ^1,2. I prokaryoter skjer denne prosessen vanligvis via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glykosylering³. Ved O-glykosylering er glykanen festet til hydroksylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rester. Ved N-glykosylering er glykanen festet til sidekjeden midt i nitrogenet til en asparagin (Asn) rester i tripeptidsekvensene Asn-X-Ser/Thr, hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre unntatt prolin.

Glykaner kan vedta lineære eller forgrenede strukturer og består av monosakkarider eller polysakkarider som er kovalent forbundet med glykosidiske bindinger. I prokaryoter viser glykaner vanligvis mangfold i sukkersammensetning og struktur i forhold til eukaryote glykaner⁴. Videre er to forskjellige bakterielle glykosyleringsveier som varierer i hvordan glykanen monteres og overføres til akseptorproteinet blitt beskrevet: sekvensiell og en blokkglykosylering ^5,6. For sekvensiell glykosylering er den komplekse glykanen bygget opp direkte på proteinet ved etterfølgende tilsetning av monosakkarider. I en blokk glykosylering overføres en forhåndsmontert glykan til proteinet fra en lipidbundet oligosakkarid av en spesialisert oligosakkaryltransferase (OTase). Begge veiene har vist seg å være involvert i N- og O-glykosyleringsprosesser⁷.

Proteinglykosylering har en rolle i modulering av proteinens fysisk-kjemiske og biologiske egenskaper. Tilstedeværelsen av en glykan kan påvirke hvordan proteinet samhandler med sin ligand, noe som påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, løselighet, følsomhet for proteolyse, immunogenisitet og mikrobevertinteraksjoner ^8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametere, for eksempel antall glykaner, glykansammensetning, posisjon og festemekanisme, også påvirke proteinfunksjon og struktur.

Glykosyltransferaser (GTs) er de viktigste enzymene i biosyntesen av komplekse glykaner og glykokonjugater. Disse enzymene katalyserer den glykosidiske bindingsdannelsen mellom en sukkermoiety fra et aktivert donormolekyl og en bestemt substrat akseptor. GTer kan bruke både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mot forskjellige substrat akseptorer, som proteiner, sakkarider, nukleinsyrer og lipider¹⁰. Derfor er det viktig å forstå GTs på molekylært nivå for å identifisere deres virknings- og spesifisitetsmekanismer, og muliggjør også å forstå hvordan sukkersammensetning av glykaner som endrer relevante molekyler er relatert til patogenisitet. Den karbohydrataktive enzymdatabasen (CAZy)¹¹ klassifiserer GT-er i henhold til deres sekvens homologi, som gir et prediktivt verktøy siden, i de fleste av GT-familiene, er den strukturelle folden og virkningsmekanismene konstante. Imidlertid gjør fire grunner det vanskelig å forutsi substratspesifisitet av mange GTs: 1) ikke noe klart sekvensmotiv som bestemmer substratspesifisitet er bestemt i prokaryoter¹², 2) mange GTs og OTases viser substrat promiscuity^13,14, 3) funksjonelle GTs er vanskelig å produsere i høy avkastning i rekombinant form og 4) identifisering av både donor og akseptor substrater er kompleks. Til tross for dette har nyere mutagenesestudier gjort det mulig å oppnå betydelige fremskritt i forståelsen av katalytiske mekanismer og trekke fra binding av GTs.

I bakterier synes O-glykosylering å være mer utbredt enn N-glykosylering. O-glykosyleringsstedene viser ikke en konsensussekvens, og mange av O-glykosylerte proteiner utskilles eller celleoverflateproteiner, for eksempel flagelliner, pili eller autotransportører¹. Flagellin glykosylering viser variasjon i antall akseptorområder, glykansk sammensetning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagellins bare ett akseptorsted, mens i Campylobacter jejuni har flagellins så mange som 19 akseptorsteder^15,16. Videre, for noen bakterier, er glykanen et enkelt monosakkarid, mens andre bakterier har heterogene glykaner kompromittert av forskjellige monosakkarider for å danne oligosakkarider. Denne heterogeniteten oppstår selv blant stammer av samme art. Helicobacter flagellins er bare modifisert av pseudaminsyre (PseAc)¹⁷, og Campylobacter flagellins kan endres av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyren (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm), og glykaner avledet fra disse sukkerene med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitusjoner ^18,19. I Aeromonas er flagelliner modifisert av glykaner hvis sammensetning spenner fra et enkelt PseAc syrederivat til et heteropolysakkarid²⁰, og vedlegg av glykaner til flagellinmonomerer er alltid via et PseAc-derivat.

Generelt er glykosylering av flagellins avgjørende for flagellarfilamentmontering, motilitet, virulens og vertsspesifikkitet. Men mens flagellins av C. jejuni¹⁶, H. pylori^17, og Aeromonas sp. ²¹ kan ikke samles i filament med mindre proteinmonomerene er glykosylerte, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. ¹⁵ krever ikke glykosylering for flagellamontering. Videre, i noen C. jejuni stammer, endringer i sukkersammensetningen av flagella glykan påvirke bakteriell-vert interaksjon og kan spille en rolle i å unngå visse immunresponser¹⁶. Autoagglutination er en annen fenotypisk egenskap påvirket av modifikasjoner i sammensetningen av glykaner forbundet med flagellins. En lavere autoagglutinasjon fører til en reduksjon i evnen til å danne mikrokolonier og biofilm²². I noen bakterier var flagellaens evne til å utløse en proinflammatorisk respons knyttet til flagellin glykosylering. Således, i P. aeruginosa, glykosylert flagellin induserer en høyere pro-inflammatorisk respons enn unglykosylert²³.

Aeromonas er Gram-negative bakterier allestedsnærværende i miljøet, noe som gjør at de kan være i grensesnittet til alle One Health-komponenter ²⁴. Mesofile Aeromonas har et enkelt polart flagellum, som er konstituativt produsert. Mer enn halvparten av kliniske isolasjoner uttrykker også lateral flagellin, inducible i medier eller plater med høy viskositet. Ulike studier har relatert begge flagellatyper med de tidlige stadiene av bakteriell patogenese²⁵. Mens polar flagellins rapportert til dags dato er O-glykosylert på 5-8 Ser eller Thr rester av sine sentrale immunogene domener, laterale flagellins er ikke O-glykosylert i alle stammer. Selv om polar flagella glykaner fra forskjellige stammer viser mangfold i karbohydratsammensetningen og kjedelengden²⁰, har koblingssukker vist seg å være et pseudaminsyrederivat.

Målet med dette manuskriptet er å beskrive en metode for å oppnå nullmutanter i spesifikke GTs eller kromosomale regioner som inneholder GTs for å analysere deres engasjement i biosyntesen av relevante polysakkarider og i bakteriell patogenisitet, samt glykanens rolle selv. Som et eksempel identifiserer og sletter vi en kromosomregion som inneholder GTer av Aeromonas for å etablere sitt engasjement i polar flagellin glykosylering og analysere rollen til flagellin glykan. Vi viser hvordan du sletter en bestemt GT for å etablere sin funksjon i biosyntesen til denne glykanen og rollen som modifisert glykan. Selv om du bruker Aeromonas som eksempel, kan prinsippet brukes til å identifisere og studere flagella glykosyleringsøyer av andre Gram-negative bakterier og analysere funksjonen til GTs involvert i biosyntesen til andre glykaner som O-antigen lipopolysakkarid.

Protocol

Den skjematiske representasjonen av prosedyren vises i figur 1. 1. Bioinformatisk identifikasjon av flagella glykosyleringsøy (FGIer) i Aeromonas For å identifisere PseAc biosyntetiske klynger i Aeromonas genomer, bruk tblastnverktøyet fra NCBI database26. Først henter du ortopediske proteiner til PseC og PseI fra A. piscicola AH-3 (identifikasjonskodene er OCA61126.1 og OCA…

Representative Results

Denne metodikken gir et effektivt system for å generere nullmutanter i gener eller kromosomale regioner i Aeromonas som kan påvirke flagellaglykosylering og rollen som flagellafilament (figur 1). Protokollen starter med bioinformatisk identifisering av putative FGIer og genene som koder GTs presenterer i denne regionen. I Aeromonas er den kromosomale plasseringen av FGIer basert på påvisning av tre typer gener: gener involvert i biosyntesen a…

Discussion

Det kritiske tidlige trinnet i denne metoden er identifisering av regioner som er involvert i glykosylering av flagella og putative GTs fordi disse enzymene viser høy homologi og er involvert i mange prosesser. Bioinformatisk analyse av Aeromonas-genomer i offentlige databaser viser at denne regionen ligger ved siden av polar flagella-regionen 2, som inneholder flagellingenene i mange stammer og inneholder gener involvert i biosyntesen av pseudaminsyre²⁷. Dette har gjort det mulig å utv…

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA