Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana
Summary
Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.
Abstract
El estudio de la glicosilación en procariotas es un área de rápido crecimiento. Las bacterias albergan diferentes estructuras glicosiladas en su superficie cuyos glicanos constituyen un código de barras específico de la cepa. Los glicanos asociados muestran una mayor diversidad en la composición y estructura del azúcar que los de los eucariotas y son importantes en los procesos de reconocimiento bacteriano-huésped y la interacción con el medio ambiente. En las bacterias patógenas, las glicoproteínas han estado involucradas en diferentes etapas del proceso infeccioso, y las modificaciones de los glicanos pueden interferir con las funciones específicas de las glicoproteínas. Sin embargo, a pesar de los avances realizados en la comprensión de la composición, la estructura y las vías de biosíntesis de los glicanos, la comprensión del papel de las glicoproteínas en la patogenicidad o la interacción con el medio ambiente sigue siendo muy limitada. Además, en algunas bacterias, las enzimas requeridas para la glicosilación de proteínas se comparten con otras vías biosintéticas de polisacáridos, como las vías biosintéticas de lipopolisacáridos y cápsulas. La importancia funcional de la glicosilación se ha dilucidado en varias bacterias a través de la mutación de genes específicos que se cree que están involucrados en el proceso de glicosilación y el estudio de su impacto en la expresión de la glicoproteína objetivo y el glicano modificador. Las Aeromonas mesófilas tienen un flagelo polar único y O-glicosilado. Los glicanos flagelares muestran diversidad en la composición de carbohidratos y la longitud de la cadena entre las cepas de Aeromonas . Sin embargo, todas las cepas analizadas hasta la fecha muestran un derivado del ácido pseudamínico como el azúcar de enlace que modifica los residuos de serina o treonina. El derivado del ácido pseudamínico es necesario para el ensamblaje de flagelos polares, y su pérdida tiene un impacto en la adhesión, la formación de biopelículas y la colonización. El protocolo detallado en este artículo describe cómo se puede utilizar la construcción de mutantes nulos para comprender la participación de genes o regiones del genoma que contienen glicosiltransferasas putativas en la biosíntesis de un glicano flagelar. Esto incluye el potencial para comprender la función de las glicosiltransferasas involucradas y el papel del glicano. Esto se logrará comparando el mutante deficiente en glicanos con la cepa de tipo salvaje.
Introduction
La glicosilación proteica se ha descrito tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas y consiste en la unión covalente de un glicano a una cadena lateralde aminoácidos 1,2. En los procariotas, este proceso generalmente ocurre a través de dos mecanismos enzimáticos principales: O- y N-glicosilación 3. En la O-glicosilación, el glicano se une al grupo hidroxilo de un residuo de serina (Ser) o treonina (Thr). En la N-glicosilación, el glicano se une a la cadena lateral de nitrógeno amida de un residuo de asparagina (Asn) dentro de las secuencias de tripéptidos Asn-X-Ser/Thr, donde X podría ser cualquier aminoácido excepto prolina.
Los glicanos pueden adoptar estructuras lineales o ramificadas y están compuestos de monosacáridos o polisacáridos unidos covalentemente por enlaces glicosídicos. En los procariotas, los glicanos suelen mostrar diversidad en la composición y estructura del azúcar en comparación con los glicanos eucariotas4. Además, se han descrito dos vías de glicosilación bacteriana diferentes que difieren en la forma en que el glicano se ensambla y se transfiere a la proteína aceptora: glicosilación secuencial y en bloque 5,6. Para la glicosilación secuencial, el complejo glicano se acumula directamente sobre la proteína mediante la adición sucesiva de monosacáridos. En la glicosilación en bloque, un glicano preensamblado se transfiere a la proteína desde un oligosacárido ligado a lípidos por una oligosacarilasa especializada (OTasa). Se ha demostrado que ambas vías están involucradas en los procesos de glicosilación N y O 7.
La glicosilación de proteínas tiene un papel en la modulación de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas. La presencia de un glicano puede influir en cómo la proteína interactúa con su ligando, lo que afecta la actividad biológica de la proteína, pero también puede afectar la estabilidad de la proteína, la solubilidad, la susceptibilidad a la proteólisis, la inmunogenicidad y las interacciones microbio-huésped 8,9. Sin embargo, varios parámetros de glicosilación, como el número de glicanos, la composición del glicano, la posición y el mecanismo de unión, también podrían afectar la función y la estructura de la proteína.
Las glicosiltransferasas (GT) son las enzimas clave en la biosíntesis de glicanos complejos y glicoconjugados. Estas enzimas catalizan la formación de enlaces glicosídicos entre una fracción de azúcar de una molécula donante activada y un aceptor de sustrato específico. Los GT pueden usar nucleótidos y no nucleótidos como moléculas donantes y dirigirse a diferentes aceptores de sustrato, como proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos y lípidos10. Por lo tanto, comprender los GT a nivel molecular es importante para identificar sus mecanismos de acción y especificidad, y también permite comprender cómo la composición de azúcar de los glicanos que modifican moléculas relevantes se relaciona con la patogenicidad. La carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 clasifica los GT según su homología de secuencia, lo que proporciona una herramienta predictiva ya que, en la mayoría de las familias GT, el pliegue estructural y los mecanismos de acción son invariantes. Sin embargo, cuatro razones dificultan la predicción de la especificidad del sustrato de muchos GT: 1) no se ha determinado un motivo de secuencia claro que determine la especificidad del sustrato en procariotas12, 2) muchos GT y OT muestran promiscuidad del sustrato13,14, 3) los GT funcionales son difíciles de producir en alto rendimiento en forma recombinante y 4) la identificación de sustratos donantes y aceptores es compleja. A pesar de ello, recientes estudios de mutagénesis han permitido obtener avances significativos en la comprensión de los mecanismos catalíticos y restar la unión de los GT.
En las bacterias, la O-glicosilación parece ser más frecuente que la N-glicosilación. Los sitios de O-glicosilación no muestran una secuencia de consenso, y muchas de las proteínas O-glicosiladas son secretadas o proteínas de la superficie celular, como flagelinas, pili o autotransportadores1. La glicosilación de flagelina muestra variabilidad en el número de sitios aceptores, la composición de glicanos y la estructura. Por ejemplo, Burkholderia spp flagellins tienen solo un sitio de aceptación, mientras que en Campylobacter jejuni, flagellins tienen hasta 19 sitios de aceptación15,16. Además, para algunas bacterias, el glicano es un solo monosacárido, mientras que otras bacterias poseen glicanos heterogéneos comprometidos de diferentes monosacáridos para formar oligosacáridos. Esta heterogenicidad ocurre incluso entre cepas de la misma especie. Las flagelinas de Helicobacter solo son modificadas por el ácido pseudamínico (PseAc)17, y las flagelinas de Campylobacter pueden ser modificadas por PseAc, la forma acetamidino del ácido pseudaminic (PseAm) o ácido legionamínico (LegAm), y los glicanos derivados de estos azúcares con acetil, N-acetilglucosamina o sustituciones propiónicas18,19. En Aeromonas, las flagelinas son modificadas por glicanos cuya composición varía desde un solo derivado ácido PseAc hasta un heteropolisacárido20, y la unión de glicanos a los monómeros de flagelina es siempre a través de un derivado PseAc.
En general, la glicosilación de las flagelinas es esencial para el ensamblaje del filamento flagelar, la motilidad, la virulencia y la especificidad del huésped. Sin embargo, mientras que flagelinas de C. jejuni16, H. pylori17, y Aeromonas sp. 21 no puede ensamblarse en filamento a menos que los monómeros de proteínas sean glicosilados, Pseudomonas spp. y Burkholderia spp. 15 no requieren glicosilación para el ensamblaje de flagelos. Además, en algunas cepas de C. jejuni , los cambios en la composición de azúcar del glicano flagelo afectan la interacción bacteriano-huésped y pueden desempeñar un papel en la evasión de ciertas respuestas inmunes16. La autoaglutinación es otra característica fenotípica afectada por modificaciones en la composición de los glicanos asociados con las flagelinas. Una menor autoaglutinación conduce a una reducción en la capacidad de formar microcolonias ybiopelícula 22. En algunas bacterias, la capacidad de los flagelos para desencadenar una respuesta proinflamatoria se relacionó con la glicosilación de flagelina. Así, en P. aeruginosa, la flagelina glicosilada induce una mayor respuesta proinflamatoria que la23 no glicosilada.
Las aeromonas son bacterias Gram-negativas omnipresentes en el medio ambiente, lo que les permite estar en la interfaz de todos los componentes de One Health 24. Las Aeromonas mesófilas tienen un solo flagelo polar, que se produce constitutivamente. Más de la mitad de los aislados clínicos también expresan flagelina lateral, inducible en medios o placas de alta viscosidad. Diferentes estudios han relacionado ambos tipos de flagelos con las primeras etapas de la patogénesis bacteriana25. Mientras que las flagelinas polares reportadas hasta la fecha son O-glicosiladas a 5-8 Ser o Thr residuos de sus dominios inmunogénicos centrales, las flagelinas laterales no son O-glicosiladas en todas las cepas. Aunque los glicanos de flagelo polar de diferentes cepas muestran diversidad en su composición de carbohidratos y longitudde cadena 20, se ha demostrado que el azúcar de enlace es un derivado del ácido pseudaminic.
El objetivo de este manuscrito es describir un método para obtener mutantes nulos en GTs específicos o regiones cromosómicas que contienen GT para analizar su participación en la biosíntesis de polisacáridos relevantes y en la patogenicidad bacteriana, así como el papel del propio glicano. Como ejemplo, identificamos y eliminamos una región cromosómica que contiene GT de Aeromonas para establecer su implicación en la glicosilación polar de flagelina y analizar el papel del glicano de flagelina. Mostramos cómo eliminar un GT específico para establecer su función en la biosíntesis de este glicano y el papel del glicano modificado. Aunque utilizando Aeromonas como ejemplo, el principio se puede utilizar para identificar y estudiar islas de glicosilación de flagelos de otras bacterias Gram-negativas y analizar la función de los GT implicados en la biosíntesis de otros glicanos como el lipopolisacárido del antígeno O.
Protocol
Representative Results
Discussion
El primer paso crítico de este método es la identificación de regiones involucradas en la glicosilación de flagelos y GTs putativos porque estas enzimas muestran alta homología y están involucradas en muchos procesos. El análisis bioinformático de los genomas de Aeromonas en bases de datos públicas muestra que esta región es adyacente a la región de flagelos polares 2, que contiene los genes de flagelina en muchas cepas y contiene genes involucrados en la biosíntesis del ácido pseudamínico<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el National Research Council Canada, para el Plan Nacional de I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, España) y para la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O’Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
