Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Summary

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Abstract

Lo studio della glicosilazione nei procarioti è un’area in rapida crescita. I batteri ospitano diverse strutture glicosilate sulla loro superficie i cui glicani costituiscono un codice a barre specifico del ceppo. I glicani associati mostrano una maggiore diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto a quelli degli eucarioti e sono importanti nei processi di riconoscimento batterico-ospite e nell’interazione con l’ambiente. Nei batteri patogeni, le glicoproteine sono state coinvolte in diverse fasi del processo infettivo e le modificazioni del glicano possono interferire con le funzioni specifiche delle glicoproteine. Tuttavia, nonostante i progressi compiuti nella comprensione della composizione, della struttura e delle vie di biosintesi del glicano, la comprensione del ruolo delle glicoproteine nella patogenicità o nell’interazione con l’ambiente rimane molto limitata. Inoltre, in alcuni batteri, gli enzimi necessari per la glicosilazione proteica sono condivisi con altre vie biosintetiche dei polisaccaridi, come il lipopolisaccaride e le vie biosintetiche delle capsule. L’importanza funzionale della glicosilazione è stata chiarita in diversi batteri attraverso la mutazione di geni specifici ritenuti coinvolti nel processo di glicosilazione e lo studio del suo impatto sull’espressione della glicoproteina bersaglio e del glicano modificante. Gli Aeromonas mesofili hanno un flagello polare singolo e O-glicosilato. I glicani flagellari mostrano diversità nella composizione dei carboidrati e nella lunghezza della catena tra i ceppi di Aeromonas . Tuttavia, tutti i ceppi analizzati fino ad oggi mostrano un derivato dell’acido pseudaminico come lo zucchero di collegamento che modifica i residui di serina o treonina. Il derivato dell’acido pseudaminico è necessario per l’assemblaggio dei flagelli polari e la sua perdita ha un impatto sull’adesione, sulla formazione di biofilm e sulla colonizzazione. Il protocollo dettagliato in questo articolo descrive come la costruzione di mutanti nulli può essere utilizzata per comprendere il coinvolgimento di geni o regioni del genoma contenenti glicosiltransferasi putative nella biosintesi di un glicano flagellare. Ciò include il potenziale per comprendere la funzione delle glicosiltransferasi coinvolte e il ruolo del glicano. Ciò sarà ottenuto confrontando il mutante carente di glicano con il ceppo wild-type.

Introduction

La glicosilazione proteica è stata descritta sia nei batteri Gram-positivi che gram-negativi e consiste nell’attaccamento covalente di un glicano a una catena laterale di amminoacidi ^1,2. Nei procarioti, questo processo di solito avviene attraverso due principali meccanismi enzimatici: O- e N-glicosilazione ³. Nella O-glicosilazione, il glicano è attaccato al gruppo ossidrile di un residuo di serina (Ser) o treonina (Thr). Nella N-glicosilazione, il glicano è attaccato all’azoto ammidico della catena laterale di un residuo di asparagina (Asn) all’interno delle sequenze tripeptidiche Asn-X-Ser/Thr, dove X potrebbe essere qualsiasi amminoacido tranne la prolina.

I glicani possono adottare strutture lineari o ramificate e sono composti da monosaccaridi o polisaccaridi legati covalentemente da legami glicosidici. Nei procarioti, i glicani di solito mostrano diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto ai glicani eucariotici⁴. Inoltre, sono state descritte due diverse vie di glicosilazione batterica che differiscono nel modo in cui il glicano viene assemblato e trasferito alla proteina accettore: glicosilazione sequenziale e in blocco ^5,6. Per la glicosilazione sequenziale, il glicano complesso viene costruito direttamente sulla proteina mediante successiva aggiunta di monosaccaridi. Nella glicosilazione in blocco, un glicano preassemblato viene trasferito alla proteina da un oligosaccaride legato ai lipidi da una oligosaccarilstransferasi specializzata (OTasi). Entrambe le vie hanno dimostrato di essere coinvolte nei processi di N- e O-glicosilazione ⁷.

La glicosilazione proteica ha un ruolo nella modulazione delle proprietà fisico-chimiche e biologiche delle proteine. La presenza di un glicano può influenzare il modo in cui la proteina interagisce con il suo ligando, che influenza l’attività biologica della proteina, ma può anche influenzare la stabilità proteica, la solubilità, la suscettibilità alla proteolisi, l’immunogenicità e le interazioni microbo-ospite ^8,9. Tuttavia, diversi parametri di glicosilazione, come il numero di glicani, la composizione del glicano, la posizione e il meccanismo di attaccamento, potrebbero anche influenzare la funzione e la struttura delle proteine.

Le glicosiltransferasi (GT) sono gli enzimi chiave nella biosintesi di glicani complessi e glicoconiugati. Questi enzimi catalizzano la formazione del legame glicosidico tra una porzione di zucchero da una molecola di donatore attivata e uno specifico accettore di substrato. I GT possono utilizzare sia nucleotidi che non nucleotidi come molecole donatrici e colpire diversi accettori di substrato, come proteine, saccaridi, acidi nucleici e lipidi¹⁰. Pertanto, comprendere le GT a livello molecolare è importante per identificare i loro meccanismi d’azione e specificità, e consente anche di capire come la composizione zuccherina dei glicani che modificano le molecole rilevanti sia correlata alla patogenicità. Il database degli enzimi Carboidrati Attivi (CAZy)¹¹ classifica i GT in base alla loro omologia di sequenza, che fornisce uno strumento predittivo poiché, nella maggior parte delle famiglie GT, la piega strutturale e i meccanismi d’azione sono invarianti. Tuttavia, quattro ragioni rendono difficile prevedere la specificità del substrato di molti GT: 1) nessun chiaro motivo di sequenza che determini la specificità del substrato è stato determinato nei procarioti¹², 2) molte GT e OT mostrano promiscuità del substrato^13,14, 3) le GT funzionali sono difficili da produrre ad alta resa in forma ricombinante e 4) l’identificazione dei substrati sia del donatore che dell’accettore è complessa. Nonostante ciò, recenti studi di mutagenesi hanno permesso di ottenere progressi significativi nella comprensione dei meccanismi catalitici e di sottrarre il legame delle GT.

Nei batteri, l’O-glicosilazione sembra essere più diffusa della N-glicosilazione. I siti di O-glicosilazione non mostrano una sequenza di consenso e molte delle proteine O-glicosilate sono secrete o proteine della superficie cellulare, come flagelline, pili o autotrasportatori¹. La glicosilazione della flagellina mostra variabilità nel numero di siti accettori, nella composizione e nella struttura del glicano. Ad esempio, Burkholderia spp flagellins ha un solo sito accettore, mentre in Campylobacter jejuni, flagellins ha ben 19 siti accettori^15,16. Inoltre, per alcuni batteri, il glicano è un singolo monosaccaride, mentre altri batteri possiedono glicani eterogenei compromessi da diversi monosaccaridi per formare oligosaccaridi. Questa eterogeneità si verifica anche tra ceppi della stessa specie. Le flagelline di Helicobacter sono modificate solo dall’acido pseudaminico (PseAc)¹⁷ e le flagelline di Campylobacter possono essere modificate da PseAc, la forma acetamidino dell’acido pseudaminico (PseAm) o dell’acido legionaminico (LegAm), e dai glicani derivati da questi zuccheri con acetil, N-acetilglucosamina o sostituzioni propioniche ^18,19. In Aeromonas, le flagelline sono modificate dai glicani la cui composizione varia da un singolo derivato dell’acido PseAc a un eteropolisaccaride²⁰, e l’attaccamento dei glicani ai monomeri della flagellina avviene sempre tramite un derivato PseAc.

In generale, la glicosilazione delle flagelline è essenziale per l’assemblaggio del filamento flagellare, la motilità, la virulenza e la specificità dell’ospite. Tuttavia, mentre flagellins di C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 e} Aeromonas sp. ²¹ non può essere assemblato in filamento a meno che i monomeri proteici non siano glicosilati, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. ¹⁵ non richiedono glicosilazione per l’assemblaggio dei flagelli. Inoltre, in alcuni ceppi di C. jejuni, i cambiamenti nella composizione zuccherina del glicano flagello influenzano l’interazione batterico-ospite e possono svolgere un ruolo nell’eludere alcune risposte immunitarie¹⁶. L’autoagglutinazione è un’altra caratteristica fenotipica influenzata dalle modifiche nella composizione dei glicani associati alle flagelline. Una minore autoagglutinazione porta ad una riduzione della capacità di formare microcolonie e biofilm²². In alcuni batteri, la capacità dei flagelli di innescare una risposta pro-infiammatoria era legata alla glicosilazione della flagellina. Pertanto, in P. aeruginosa, la flagellina glicosilata induce una risposta pro-infiammatoria più elevata rispetto a²³ non glicosilata.

Aeromonas sono batteri Gram-negativi onnipresenti nell’ambiente, che consente loro di essere all’interfaccia di tutti i componenti One Health ²⁴. Gli Aeromonas mesofili hanno un singolo flagello polare, che è prodotto costitutivamente. Più della metà degli isolati clinici esprime anche flagellina laterale, inducibile in mezzi o piastre ad alta viscosità. Diversi studi hanno correlato entrambi i tipi di flagelli con le prime fasi della patogenesi batterica²⁵. Mentre le flagelline polari riportate fino ad oggi sono O-glicosilate a 5-8 residui di Ser o Thr dei suoi domini immunogenici centrali, le flagelline laterali non sono O-glicosilate in tutti i ceppi. Sebbene i glicani flagella polari di diversi ceppi mostrino diversità nella loro composizione di carboidrati e lunghezza della catena²⁰, lo zucchero di collegamento ha dimostrato di essere un derivato dell’acido pseudaminico.

L’obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo per ottenere mutanti nulli in specifici GT o regioni cromosomiche contenenti GT per analizzare il loro coinvolgimento nella biosintesi di polisaccaridi rilevanti e nella patogenicità batterica, nonché il ruolo del glicano stesso. Ad esempio, identifichiamo ed eliminiamo una regione cromosomica contenente GT di Aeromonas per stabilire il suo coinvolgimento nella glicosilazione della flagellina polare e analizzare il ruolo del glicano flagellino. Mostriamo come eliminare un GT specifico per stabilirne la funzione nella biosintesi di questo glicano e il ruolo del glicano modificato. Sebbene si utilizzi Aeromonas come esempio, il principio può essere utilizzato per identificare e studiare le isole di glicosilazione dei flagelli di altri batteri Gram-negativi e analizzare la funzione dei GT coinvolti nella biosintesi di altri glicani come il lipopolisaccaride dell’antigene O.

Protocol

La rappresentazione schematica della procedura è illustrata nella Figura 1. 1. Identificazione bioinformatica dell’isola di glicosilazione dei flagelli (FGI) in Aeromonas Per identificare i cluster biosintetici PseAc nei genomi di Aeromonas , utilizzare lo strumento tblastn dal database NCBI26. In primo luogo, recuperare le proteine ortologhe a PseC e PseI di A. piscicola AH-3 …

Representative Results

Questa metodologia fornisce un sistema efficace per generare mutanti nulli in geni o regioni cromosomiche di Aeromonas che possono influenzare la glicosilazione dei flagelli e il ruolo del filamento flagello (Figura 1). Il protocollo inizia con l’identificazione bioinformatica delle FGI putative e dei geni che codificano per le GT presenti in questa regione. In Aeromonas, la posizione cromosomica delle FGI si basa sulla rilevazione di tre tipi di…

Discussion

Il primo passo critico di questo metodo è l’identificazione delle regioni coinvolte nella glicosilazione dei flagelli e dei presunti GT perché questi enzimi mostrano un’elevata omologia e sono coinvolti in molti processi. L’analisi bioinformatica dei genomi di Aeromonas in database pubblici mostra che questa regione è adiacente alla regione dei flagelli polari 2, che contiene i geni flagellina in molti ceppi e contiene geni coinvolti nella biosintesi dell’acido pseudaminico²⁷. Ciò ha …

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA