ACT1-CUP1-assays bestemmer de substratspecifikke følsomheder af spliceosomale mutanter i spirende gær

Summary

ACT1-CUP1-analysen, et kobbervækstassay, giver en hurtig aflæsning af precursor messenger RNA (pre-mRNA) splejsning og den indvirkning, mutante splejsningsfaktorer har på splejsningsfunktionen. Denne undersøgelse giver en protokol og fremhæver den tilpasning, der er mulig for at løse splejsningsspørgsmålet af interesse.

Abstract

Mutationer introduceret i spliceosomet eller dets substrat har bidraget væsentligt til vores forståelse af forviklingerne ved splejseosomal funktion. Uanset om de er sygdomsrelaterede eller funktionelt udvalgte, er mange af disse mutationer blevet undersøgt ved hjælp af vækstassays i modelorganismen Saccharomyces cerevisiae (gær). Det splejsningsspecifikke kobbervækstassay eller ACT1-CUP1-assay giver en omfattende analyse af mutation på fænotypisk niveau. ACT1-CUP1-analysen bruger journalister, der giver kobbertolerance, når de er korrekt splejset. I nærværelse af kobber korrelerer ændringer i gærlevedygtighed således med ændringer i mRNA-produktion gennem splejsning. I et typisk eksperiment udfordres gærsplejsningsomet med forskellige ikke-konsensussplejsningsreportere og splejsningsfaktormutationen af interesse for at opdage enhver synergetisk eller antitetisk indvirkning på splejsning. Her gives en fuldstændig beskrivelse af kobberpladeforberedelse, plettering af gærceller og dataevaluering. Et udvalg af gratis eksperimenter er beskrevet, hvilket fremhæver alsidigheden af ACT1-CUP1-journalisterne. ACT1-CUP1-analysen er et praktisk værktøj i splejsningsværktøjskassen takket være den direkte aflæsning af mutationseffekt(er) og de komparative muligheder fra den fortsatte brug i marken.

Introduction

Spliceosomet er en stor, biologisk maskine, der katalyserer fjernelsen af introns, ikke-kodende regioner i precursor messenger RNA (pre-mRNA)^1,2. At karakterisere effekten af en enkeltpunktsmutant i 1 af de næsten 100 proteiner og 5 ikke-kodende RNA’er er ofte tvetydigt, når man studerer proteinet eller RNA’et isoleret. Ændringen i den muterede komponents funktion kan bedst evalueres in vivo i sammenhæng med det fulde, fungerende splejseosom.

Kobbervækstanalysen beskrevet her er en hurtig måling af splejsningseffektiviteten i Saccharomyces cerevisiae eller spirende gær. Udviklet af C.F. Lesser og C. Guthrie og udgivet i 1993, kombinerer dette assay letheden ved at arbejde med en simpel modelorganisme og den ligefremme aflæsning af cellelevedygtighed³. Levedygtigheden korrelerer med, hvor godt splejsningsomerne i disse celler kan genkende og splejse reporterudskriften.

Dette kobbervækstassay kaldes mere almindeligt ACT1-CUP1-analysen. Navnet ACT1-CUP1 stammer fra de to gener, der er smeltet sammen for at skabe en reporter af splejsningseffektivitet. ACT1 er gærens actingen, som udtrykkes meget og har en effektivt splejset intron ^4,5. Cup1p er en kobberchelator, der binder kobber i cellen for at forhindre interferens med regelmæssige cellulære funktioner ^6,7,8. ACT1-CUP1-reporteren indeholder disse gener i rækkefølge, således at CUP1 kun er i den korrekte læseramme, hvis præ-mRNA-splejsning af ACT1’s intron forekommer (figur 1). Det resulterende fusionsprotein indeholder de første 21 aminosyrer af actin og cup1p-proteinet i fuld længde, hvilket øger gærens levedygtighed i et kobberrigt miljø³. Således resulterer en stigning i mængden af splejsning af reporteren i en højere koncentration af Cup1p og en højere kobbermodstand (figur 1). I sammenligning med andre reportergener påvirker CUP1 cellelevedygtigheden selv ved lave niveauer, har et bredt følsomhedsområde og kan bruges til direkte at vælge til splejsning af mutationer ^3,6,7. Derudover er CUP1 ikke essentiel for standard gærvækst, og derfor påvirkes cellulær homeostase ikke under opsætningen til dette assay. Som supplement til sletnings- eller temperaturvækstassays giver ACT1-CUP1 information om virkningerne på splejsning under ellers optimale gærvækstbetingelser.

Spliceosomet genkender sit substrat gennem tre introniske sekvenser, nemlig 5’splejsningsstedet (5′ SS), grenstedet (BS) og 3’splejsningsstedet (3′ SS). Talrige ACT1-CUP1-journalister er blevet genereret, der indeholder ikke-konsensussekvenser på disse websteder. Et udvalg af de mest almindelige ACT1-CUP1-reportere er vist i figur 1 og tabel 1. Da splejsningssomet interagerer med hvert splejsningssted unikt på forskellige punkter i splejsningscyklussen, kan splejsningsprogrammets robusthed testes på forskellige trin baseret på, hvilken ikke-konsensusreporter der bruges. Ikke-konsensusreportere er opkaldt efter den muterede position inden for intron og den base, den blev muteret til. For eksempel er A3c en reporter med en mutation ved 5 ‘SS, specifikt position 3 fra konsensusadenosin til en cytosin. Denne reporter vil interagere stærkt med splejseosommutationer, der påvirker 5 ‘SS-udvælgelse og brug. I deres indledende undersøgelse bestemte Lesser og Guthrie, hvilke 5 ‘SS-mutationer der hæmmede splejsning³. Senere samme år blev ikke-konsensusreportere på alle tre splejsningssteder offentliggjort af Burgess og Guthrie i en suppressorskærm af mutationer i ATPase Prp16p⁹. Ved at sammenligne konsensus med ikke-konsensusjournalister har ACT1-CUP1-analysen været en vigtig nøgle til at forstå robustheden og selektiviteten af gærsplejsningsomet og til at udlede funktionen af andre eukaryoters splejsningsomer.

Da ikke-konsensus ACT1-CUP1-journalister sensibiliserer splejsningsomet til yderligere forstyrrelse, kan virkningen af en enkelt splejsningsfaktormutation karakteriseres gennem de journalister, den påvirker positivt eller negativt. Dette er blevet anvendt til splejsning af forskningsspørgsmål på forskellige måder. For det første kan og er ACT1-CUP1-analysen blevet brugt som en genetisk skærm for mutationer i splejsningsfaktorer. For eksempel tjener Prp8p, det største splejsningsprotein, som en platform, hvorpå RNA-kernen i splejseosomet katalyserer splejsningsreaktionen. Dette blev delvist udledt af, hvordan Prp8p-mutanter forbedrede eller reducerede splejsningen af forskellige ACT1-CUP1-journalister 10,11,12,13,14,15,16,17. Andre proteinkomponenter i splejseosomet er også blevet undersøgt ved anvendelse af ACT1-CUP1, herunder Hsh155p, Cwc2p, Cef1p og Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiske tærskler for Prp16p og fire andre ATPaser involveret i spliceosomal overgang er også blevet undersøgt med dette assay 9,26,27,28,29,30. De små nukleare RNA’er (snRNA’er) er også blevet grundigt undersøgt ved hjælp af ACT1-CUP1 til at identificere de pre-mRNA-sekvenser, de koordinerer, og ændringerne i sekundær struktur, som snRNA’erne gennemgår under splejsning 3,31,32,33,34,35,36,37.

ACT1-CUP1-analysen kræver en gærstamme, hvor alle kopier af CUP1-genet er blevet slået ud. Da CUP1 kan have et højt kopinummer ^6,38, kan forberedelse af en fuld knock-out-stamme kræve flere runder eller omfattende screening. Som et resultat er cup1Δ gærstammer ofte blevet delt mellem laboratorier, ligesom journalisterne.

Hvis mutation(er) i en splejsningsfaktor vurderes ud fra en plasmidkopi, skal vildtypegenet for denne faktor slås ud. Derudover bør gærbaggrunden give mulighed for udvælgelse af mindst to plasmider, en indeholdende en ACT1-CUP1-reporter, historisk på et leucin næringsstofudvælgelsesplasmid, og en indeholdende en mutation eller forstyrrelse i splejsningsmaskineriet, der vil blive undersøgt (figur 2). Normalt vil flere gærstammer, der hver bærer forespørgselssplejsningsforstyrrelsen (QSP) og en anden reporter, i et enkelt assay teste forespørgslens indvirkning på splejsning.

De uafhængige variabler i ACT1-CUP1-analysen gør det muligt for en forsker at vurdere sværhedsgraden af en QSP. Disse uafhængige variabler er koncentrationen af kobber og udvælgelsen af flere ikke-konsensussplejsende journalister. For det første, da gærstammerne dyrkes på plader, der indeholder en række kobberkoncentrationer (figur 2), omfatter oprettelsen af analysen valg af gradienten af anvendte koncentrationer. Undersøgelser kan bruge et kursus kobberkoncentrationsgradient til at få en indledende aflæsning af levedygtighed og derefter gentage analysen med en finere gradient for at identificere subtile levedygtighedsforskelle. Den anden variabel er den brede vifte af ACT1-CUP1-reportere, der er mulige at teste (figur 1 og tabel 1). Hvis QSP påvirker gærens levedygtighed forskelligt i nærværelse af en ikke-konsensusreporter versus vildtype, kan der drages en konklusion om, at QSP påvirker et trin i splejsning eller en region af splejsningen, der er vigtig under anerkendelsen eller behandlingen af den pågældende region i intron.

Gærværktøjskassen er omfattende, og ACT1-CUP1-analysen er en integreret del af splejsningsforskningen. ACT1-CUP1-analysen udføres ofte sammen med en mere dybtgående genetisk, strukturel og / eller biokemisk analyse af virkningen af en QSP. Da disse mere detaljerede undersøgelser generelt har en længere procedure og / eller højere pris, er en hyppig tilgang screening for interessante mutanter med ACT1-CUP1 først.

Forudsat her er en ACT1-CUP1 assay protokol, herunder kobberplade forberedelse. Dette assay giver forskere et indledende svar på en QSP’s effekt på splejsning, og hvilke introniske regioner der er mest påvirket af forstyrrelsen.

Protocol

1. Gærstamme konstruktion Generer eller opnå en S. cerevisiae-stamme , hvis baggrund inkluderer leu2 og cup1Δ. For at generere denne baggrund skal du bruge den veletablerede gærmetode, der anvender lithiumacetat og enkeltstrenget DNA39.BEMÆRK: Haploide gærstammer kan indeholde en, to eller flere kopier af CUP1 6,38. Se genomisk information for den valgte gærstamme, n…

Representative Results

Vækstanalyser, som ACT1-CUP1, kræver visuel, sammenlignende vurdering af flere kolonier. Her blev hver stamme dyrket til mætning natten over, fortyndet til en OD600 på 0,5 og belagt på 20 plader indeholdende en række kobberkoncentrationer fra 0 mM til 1,1 mM CuSO4 (figur 3). Dette interval er mindre end det, der er anført i protokollen, da det gav mulighed for en fuldstændig vurdering af virkningen af de QSP’er og ACT1-CUP1-reportere, der blev brugt og beskrevet…

Discussion

ACT1-CUP1 er et vækstassay, og man skal sørge for, at observerede vækstforskelle kun kan tilskrives splejsningsdefekter. Alle stammer skal håndteres på en lignende måde inden plettering, herunder have en lignende længde og type vækst- og opbevaringsforhold. Hvis der anvendes temperaturfølsomme stammer, bør ACT1-CUP1-assays kun udføres under forhold, hvor disse stammer vokser sammenligneligt med vildtypen. Relateret anbefales det for QSP-komponenten at have identiske gærbaggrunde og ekspressionsniveauer for QS…

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-138	Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	07-201-332	Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate	Fisher Scientific	07-200-760	Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)	CellTreat Scientific Products	229707	Or comparable item from a different manufacturer.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Any molecular grade agar will work.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner	Humboldt	PN6200.1	Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter	VWR	490005-906	Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate	Fisher Scientific	LC134051	Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera	Nikon	D3500	Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp	Fisher Scientific	05-769-7Q	Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp	Fisher Scientific	12-000-101	Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-51	Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes	VWR	97000-590	Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker	JEIO Tech	IST-3075	Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer	Biowave	80-3000-45	Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates	VWR	102091-156	Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate	Fisher Scientific	11-520-16S	Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base	USBiological Life Sciences	Y2025	Or comparable item from a different manufacturer.