I saggi ACT1-CUP1 determinano le sensibilità specifiche del substrato dei mutanti spliceosomi nel lievito in erba

Summary

Il test ACT1-CUP1, un saggio di crescita del rame, fornisce una rapida lettura dello splicing dell’RNA messaggero precursore (pre-mRNA) e dell’impatto che i fattori di splicing mutante hanno sulla funzione spliceosomale. Questo studio fornisce un protocollo ed evidenzia la personalizzazione possibile per affrontare la questione di splicing di interesse.

Abstract

Le mutazioni introdotte nello spliceosoma o nel suo substrato hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della complessità della funzione spliceosomiale. Che siano correlate alla malattia o funzionalmente selezionate, molte di queste mutazioni sono state studiate utilizzando saggi di crescita nell’organismo modello Saccharomyces cerevisiae (lievito). Il saggio di crescita del rame specifico per lo splicing, o test ACT1-CUP1, fornisce un’analisi completa della mutazione a livello fenotipico. Il test ACT1-CUP1 utilizza reporter che conferiscono tolleranza al rame quando giuntati correttamente. Pertanto, in presenza di rame, i cambiamenti nella vitalità del lievito sono correlati ai cambiamenti nella produzione di mRNA attraverso lo splicing. In un tipico esperimento, lo spliceosoma del lievito viene sfidato con diversi reporter di splicing non consensuali e la mutazione del fattore di splicing di interesse per rilevare qualsiasi impatto sinergico o antitetico sullo splicing. Qui viene fornita una descrizione completa della preparazione della piastra di rame, della placcatura delle cellule di lievito e della valutazione dei dati. Viene descritta una selezione di esperimenti complementari, evidenziando la versatilità dei reporter ACT1-CUP1. Il test ACT1-CUP1 è uno strumento utile nella cassetta degli attrezzi di splicing grazie alla lettura diretta degli effetti mutazionali e alle possibilità comparative derivanti dall’uso continuo sul campo.

Introduction

Lo spliceosoma è una grande macchina biologica che catalizza la rimozione degli introni, regioni non codificanti nell’RNA messaggero precursore (pre-mRNA)^1,2. Caratterizzare l’effetto di un mutante a singolo punto in 1 delle quasi 100 proteine e 5 RNA non codificanti è spesso ambiguo quando si studia la proteina o l’RNA in isolamento. Il cambiamento nella funzione del componente mutato può essere valutato meglio in vivo nel contesto dello spliceosoma completo e funzionante.

Il saggio di crescita del rame qui descritto è un rapido indicatore dell’efficienza di splicing in Saccharomyces cerevisiae o lievito in erba. Sviluppato da C.F. Lesser e C. Guthrie e pubblicato nel 1993, questo test combina la facilità di lavoro con un semplice organismo modello e la lettura diretta della vitalità cellulare³. La vitalità è correlata al modo in cui gli spliceosomi in queste cellule possono riconoscere e unire la trascrizione del reporter.

Questo saggio di crescita del rame è più comunemente chiamato test ACT1-CUP1. Il nome ACT1-CUP1 deriva dai due geni fusi per creare un reporter di efficienza di splicing. ACT1 è il gene dell’actina del lievito, che è altamente espresso e ha un^{introne 4,5} efficientemente giuntato. Cup1p è un chelante del rame che sequestra il rame nella cellula per prevenire interferenze con le normali funzioni cellulari ^6,7,8. Il reporter ACT1-CUP1 contiene questi geni in sequenza tale che CUP1 è nel frame di lettura corretto solo se si verifica lo splicing pre-mRNA dell’introne di ACT1 (Figura 1). La proteina di fusione risultante contiene i primi 21 aminoacidi di actina e la proteina Cup1p a lunghezza intera, che aumenta la vitalità del lievito in un ambiente ricco di rame³. Pertanto, un aumento della quantità di giunzione del reporter si traduce in una maggiore concentrazione di Cup1p e una maggiore resistenza al rame (Figura 1). Rispetto ad altri geni reporter, CUP1 influisce sulla vitalità cellulare anche a bassi livelli, ha un ampio intervallo di sensibilità e può essere utilizzato per selezionare direttamente le mutazioni di splicing ^3,6,7. Inoltre, CUP1 non è essenziale per la crescita standard del lievito, e quindi l’omeostasi cellulare non è influenzata durante la configurazione di questo test. Complementare ai saggi di delezione o crescita della temperatura, ACT1-CUP1 fornisce informazioni sugli effetti sullo splicing in condizioni di crescita del lievito altrimenti ottimali.

Lo spliceosoma riconosce il suo substrato attraverso tre sequenze introniche, vale a dire il sito di giunzione 5′ (5′ SS), il sito di diramazione (BS) e il sito di giunzione 3′ (3′ SS). Sono stati generati numerosi reporter ACT1-CUP1 contenenti sequenze non consensuali in questi siti. Una selezione dei reporter ACT1-CUP1 più comuni è mostrata nella Figura 1 e nella Tabella 1. Poiché lo spliceosoma interagisce con ciascun sito di giunzione in modo univoco in diversi punti del ciclo di giunzione, la robustezza dello spliceosoma può essere testata in diversi passaggi in base ai quali viene utilizzato il reporter non consensuale. I giornalisti non di consenso sono chiamati per la posizione mutata all’interno dell’introne e la base in cui è stato mutato. Ad esempio, A3c è un reporter con una mutazione al 5′ SS, in particolare posizione 3 dall’adenosina di consenso a una citosina. Questo reporter interagirà fortemente con le mutazioni degli spliceosomi che influenzano la selezione e l’uso di 5′ SS. Nel loro studio iniziale, Lesser e Guthrie hanno determinato quali mutazioni 5′ SS hanno inibito lo splicing³. Più tardi, nello stesso anno, Burgess e Guthrie pubblicarono rapporti non consensuali in tutti e tre i siti di giunzione in uno schermo soppressore delle mutazioni nell’ATPasi Prp16p⁹. Confrontando il consenso con i giornalisti non di consenso, il test ACT1-CUP1 è stato una chiave importante per comprendere la robustezza e la selettività dello spliceosoma del lievito e per dedurre la funzione degli spliceosomi di altri eucarioti.

Poiché i giornalisti ACT1-CUP1 non consensuali sensibilizzano lo spliceosoma a ulteriori perturbazioni, l’impatto di una singola mutazione del fattore di splicing può essere caratterizzato attraverso i reporter che ha un impatto positivo o negativo. Questo è stato applicato allo splicing delle domande di ricerca in vari modi. In primo luogo, il test ACT1-CUP1 può ed è stato utilizzato come screening genetico per le mutazioni nei fattori di splicing. Ad esempio, Prp8p, la più grande proteina di splicing, funge da piattaforma su cui il nucleo di RNA dello spliceosoma catalizza la reazione di splicing. Ciò è stato dedotto, in parte, attraverso il modo in cui i mutanti Prp8p hanno migliorato o ridotto lo splicing di diversi reporter ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Altri componenti proteici dello spliceosoma sono stati studiati utilizzando ACT1-CUP1, tra cui Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ed Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Le soglie energetiche per Prp16p e altre quattro ATPasi coinvolte nella transizione spliceosomiale sono state studiate anche con questo test 9,26,27,28,29,30. I piccoli RNA nucleari (snRNA) sono stati anche ampiamente studiati utilizzando ACT1-CUP1 per identificare le sequenze di pre-mRNA che coordinano e i cambiamenti nella struttura secondaria che gli snRNA subiscono durante lo splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.

Il test ACT1-CUP1 richiede un ceppo di lievito in cui tutte le copie del gene CUP1 sono state eliminate. Poiché CUP1 può avere un numero di copie elevato ^6,38, la preparazione di un ceppo knock-out completo può richiedere più round o uno screening approfondito. Di conseguenza, i ceppi di lievito cup1Δ sono stati spesso condivisi tra i laboratori, così come i giornalisti.

Se le mutazioni in un fattore di splicing vengono valutate da una copia plasmide, il gene wild-type per questo fattore dovrebbe essere eliminato. Inoltre, il background del lievito dovrebbe consentire la selezione di almeno due plasmidi, uno contenente un reporter ACT1-CUP1, storicamente su un plasmide di selezione dei nutrienti leucina, e uno contenente una mutazione o perturbazione nel meccanismo di splicing che verrà studiato (Figura 2). Di solito, in un singolo test, più ceppi di lievito, ciascuno con la perturbazione dello splicing della query (QSP) e un reporter diverso, testeranno l’impatto della query sullo splicing.

Le variabili indipendenti nel test ACT1-CUP1 consentono a un ricercatore di valutare la gravità di un QSP. Queste variabili indipendenti sono la concentrazione di rame e la selezione di più reporter di giunzione non consensuali. In primo luogo, poiché i ceppi di lievito vengono coltivati su piastre contenenti una gamma di concentrazioni di rame (Figura 2), l’impostazione del saggio include la selezione del gradiente di concentrazioni utilizzate. Gli studi possono utilizzare un gradiente di concentrazione di rame del corso per ottenere una lettura iniziale della vitalità e quindi ripetere il test con un gradiente più fine per identificare sottili differenze di vitalità. La seconda variabile è l’ampia gamma di reporter ACT1-CUP1 che possono essere testati (Figura 1 e Tabella 1). Se il QSP influisce sulla vitalità del lievito in modo diverso in presenza di un reporter non di consenso rispetto al wild-type, si può concludere che il QSP influisce su una fase dello splicing o su una regione dello spliceosoma importante durante il riconoscimento o l’elaborazione di quella regione dell’introne.

La cassetta degli attrezzi del lievito è ampia e il test ACT1-CUP1 è parte integrante della ricerca sullo splicing. Il test ACT1-CUP1 viene spesso eseguito insieme a un’analisi genetica, strutturale e/o biochimica più approfondita sull’impatto di un QSP. Poiché questi studi più dettagliati hanno generalmente una procedura più lunga e / o un prezzo più alto, un approccio frequente è lo screening di mutanti interessanti con ACT1-CUP1 prima.

A condizione che qui sia presente un protocollo di analisi ACT1-CUP1, inclusa la preparazione della piastra di rame. Questo test fornisce ai ricercatori una risposta iniziale all’effetto di un QSP sullo splicing e quali regioni introniche sono maggiormente influenzate dalla perturbazione.

Protocol

1. Costruzione del ceppo di lievito Generare o ottenere un ceppo di S. cerevisiae il cui background include leu2 e cup1Δ. Per generare questo background, utilizzare il metodo del lievito ben consolidato che impiega acetato di litio e DNA a singolo filamento39.NOTA: I ceppi di lievito aploidi possono contenere una, due o più copie di CUP1 6,38. Fare riferimento alle inform…

Representative Results

I saggi di crescita, come ACT1-CUP1, richiedono la valutazione visiva e comparativa di più colonie. Qui, ogni ceppo è stato coltivato fino alla saturazione durante la notte, diluito a un OD600 di 0,5 e placcato su 20 piastre contenenti un intervallo di concentrazioni di rame da 0 mM a 1,1 mM CuSO4 (Figura 3). Questo intervallo è inferiore a quello elencato nel protocollo in quanto ha consentito la valutazione completa dell’impatto dei QSP e dei reporter ACT1-CUP1 uti…

Discussion

ACT1-CUP1 è un test di crescita e occorre prestare attenzione per garantire che le differenze di crescita osservate possano essere attribuite solo a difetti di splicing. Tutti i ceppi devono essere manipolati in modo simile prima della placcatura, compresa la lunghezza e il tipo di crescita e condizioni di conservazione simili. Se si utilizzano ceppi sensibili alla temperatura, i saggi ACT1-CUP1 devono essere eseguiti solo in condizioni in cui tali ceppi crescono in modo comparabile al tipo selvatico. In relazione a ci?…

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-138	Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	07-201-332	Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate	Fisher Scientific	07-200-760	Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)	CellTreat Scientific Products	229707	Or comparable item from a different manufacturer.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Any molecular grade agar will work.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner	Humboldt	PN6200.1	Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter	VWR	490005-906	Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate	Fisher Scientific	LC134051	Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera	Nikon	D3500	Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp	Fisher Scientific	05-769-7Q	Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp	Fisher Scientific	12-000-101	Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-51	Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes	VWR	97000-590	Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker	JEIO Tech	IST-3075	Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer	Biowave	80-3000-45	Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates	VWR	102091-156	Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate	Fisher Scientific	11-520-16S	Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base	USBiological Life Sciences	Y2025	Or comparable item from a different manufacturer.