본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.
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방법 논문
핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
단백질 결합 아르기닌은 일반적으로 많은 단백질에서 메틸화되며 물리 화학적 특성, 다른 단백질 또는 핵산을 포함한 다른 분자와의 상호 작용을 변경함으로써 기능을 조절합니다. 이 연구는 비대칭 및 대칭 디메틸아르기닌(각각 ADMA 및 SDMA) 및 모노메틸 아르기닌(MMA)을 포함하여 아르기닌과 그 유도체를 정량화하기 위한 쉽게 구현할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 생물학적 체액, 조직 또는 세포 용해물로부터 단백질을 분리한 후, 균질화, 단백질의 침전 및 단백질 가수분해를 위한 간단한 방법이 설명된다. 가수분해물에는 다른 아미노산, 지질 및 핵산과 같은 많은 다른 성분이 포함되어 있기 때문에 고체상 추출(SPE)을 사용한 정제 단계가 필수적입니다. SPE는 원심분리기 또는 피펫팅 로봇을 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 현재 프로토콜을 사용하는 ADMA의 감도는 약 100nmol/L입니다. 아르기닌의 검출 상한은 SPE 포화로 인해 3mmol/L입니다. 요약하면, 이 프로토콜은 생물학적 샘플 준비에서 NMR 기반 검출에 이르는 강력한 방법을 설명하며, 아르기닌 메틸롬을 연구할 때 성공적인 작업을 위한 귀중한 힌트와 함정을 제공합니다.
서론
지난 20 년 동안 아르기닌 잔기의 메틸화는 단백질의 필수적인 번역 후 변형으로 인식되었습니다. 그것은 전사 조절, 신호 전달 등과 같은 기본적인 생물학적 과정에 영향을 미칩니다1. 아르기닌 메틸화 조절에 관여하는 주요 단백질은 단백질 아르기닌 메틸 전이 효소 (PRMT)2. 아르기닌의 주요 유도체는 ω- (NG, NG)- 비대칭 디메틸 아르기닌 (ADMA), ω- (NG, NG)- 대칭 디메틸 아르기닌 (SDMA) 및 ω-NG- 모노 메틸 아르기닌 (MMA)2입니다.
PRMT는 S- 아데노 실 -l- 메티오닌을 사용하여 메틸기를 단백질 결합 아르기닌1의 말단 구아니디노 그룹 (두 개의 동등한 아미노기 포함)으로 전달합니다. 두 가지 주요 효소를 구별 할 수 있습니다 : 유형 I 및 유형 II 효소는 MMA를 형성하기 위해 첫 번째 메틸화 단계를 촉매합니다 (따라서 대칭을 잃습니다). 이 단계에 따라 I형 효소(예: PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8)는 MMA를 기질로 사용....
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프로토콜
효모 단백질 가수분해물을 본 연구의 대표적인 결과를 위한 샘플로 사용하였다. 전체 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.
1. 재료 및 시약의 제조
- 메탄올 / 물 : 99 % 메탄올 (MeOH) 2 부분과 MeOH / H2O로 지정된 H 2 O 1 부분의 혼합물을 준비합니다. 알코올 증발을 최소화하고 샘플 안정성을 높이기 위해 -20 ° C에서 순수한 MeOH 및 MeOH / H2O를 보관하십시오.
- 염산 (HCl) : 농축 HCl (12.0 mol / L 또는 37 %)과 0.1 mol / L의 HCl에서 9 mol / L를 희석하십시오. 고농축(9mol/L) 용액은 단백질 가수분해에 사용되는 반면 저농축(0.1mol/L) 용액은 고상 추출에 사용됩니다.
주의 : 흄 후드 내부에서 작업하십시오. - 포화 암모니아 용액 10%(재고: 암모니아 30% w/w), 메탄올 50% 및 물 40%(v/v)를 포함하는 SPE용 교체 용액을 준비합니다.
- NMR 완충액: 5.56g의 인산이나트륨(Na2HPO4, 0.08mol/
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결과
일상적으로, 2D J-분해능(JRES), 사실상 분리된 NMR 스펙트럼의 1H 1D투영이 당사 실험실(36)에서 피크 할당 및 정량화를 위해 사용된다. 도 3은 본 SPE 프로토콜을 사용하여 정제된 효모 단백질 가수분해물의 대표적인 JRES 스펙트럼을 나타낸다. 농도는 매우 다르지만 두 물질은 세포 매트릭스에서 분리되고 정량화 될 수 있습니다. 각각의 화학적 이동에서 특정 메틸 (-CH3) 또는 메틸렌 (-CH2-) 그룹의 양성자 수를 기준으로 1H-NMR 분광법은 정확한 정량화를 허용합니다. 프로토콜(단계 0)에서 지적한 바와 같이, 아르기닌과 비교한 메틸-아르기닌 유도체의 상대적 정량화는 주로 생물학적 과정, 예를 들어 유전자의 녹다운/과발현, 영양소의 변화 또는 억제제 처리와 같은 조절에 대한 반응으로서 아르기닌 메틸화의 변화를 관찰하는 데 적합합니다.......
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토론
다음 섹션에서는 메서드 자체에 중점을 둡니다. 아르기닌 메틸화의 생물학적 의미는 소개 섹션에 설명되어 있습니다.
첫째, 다른 강성의 조직은 샘플 용해의 조정이 필요할 수 있습니다 : 세포 배양 (박테리아, 효모 등 포함)의 세포와 뇌, 젊은 간, 평활근 등과 같은 조직은 신속하게 균질화 될 수 있습니다. 높은 강성 조직 (노인 피험자의 간, 동맥, 뼈 등 포함)의 경우 균질화를 두 번 수행해야합니다 (3.2.3 단계 참조). 그럼에도 불구하고,이 과정은 일부 불용성 잔류 물이 남아 있더라도 더 자주 계속되어서는 안됩니다. 대신, 샘플을 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 추가 분석을 위해 상청액을 수집해야 합니다(샘플 분해를 최소화하기 위해).
샘플이 동결되는 각 단계(초기에는 MeOH를 첨가한 후, 각각 3.3, 3.4 또는 3.5단계) 또는 동결건조 후(단계 4.4 및 6.1), 샘플은 추가 처리.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF) 보조금 P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (주력 프로젝트 DYNIMO), 오스트리아 연구 진흥 기관 (FFG) 보조금 864690 및 870454, 통합 대사 연구 센터 그라츠; 오스트리아 인프라 프로그램 2016/2017, 스티 리아 정부 (Zukunftsfonds) 및 복건 의과 대학의 고급 인재를위한 스타트 업 펀드 (XRCZX2021020). 세포 배양 시설에 대한 접근을 위해 의료 연구 센터에 감사드립니다. F.Z.는 그라츠 의과 대학의 분자 의학 박사 프로그램 프레임 내에서 교육을 받았습니다. Q.Z.는 그라츠 의과 대학의 대사 및 심혈관 질환 박사 프로그램의 틀 내에서 교육을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15mL 튜브 | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) 프로피온산-2,2,3,3-d4 나트륨 염(TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5mL 튜브, 둥근 바닥 | Greiner Bio One | 115101 | |
| 암모니아 용액 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600MHz NMR 분광계, TXI 프로브 헤드 | 장착 Bruker | - | |
| 원심분리기, 냉장, 예: 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥ 연 99% | Roth | 3313.1 | |
| 중수소 산화물 (D<>sub2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| 건조 챔버 | 바인더 | 9090-0018 | |
| DURAN 배양 튜브, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards 딥 진공 오일 펌프 RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | SpeedVac 시스템의 일부 |
| Eppendorf 1.5 mL 튜브 | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson 피펫팅 로봇 GX-241 Aspec | Gilson Inc. | ||
| L-아르기닌 | AppliChem | A3675 | |
| 메탄올 ≥ 99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q 물 아파라투스 | Millipore ZIQ7000T0 | ||
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL 카트리지 | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 조직 균질화 Bertin | 기기 | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm 지르코늄 산화물 비드 | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap 가열, 교반 및 증발 모듈 | Thermo Scientific | TS-18820 | |
| 1.5 mL 튜브용 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 로터, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant 냉장 냉각 트랩 | Thermo Scientific | 15996161 | SpeedVac 시스템의 일부 |
| Savant SpeedVac 진공 농축기 SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | SpeedVac 시스템의 일부; 장착 1.5 ml 튜브용 로터 포함 |
| , PTFE 밀봉 유리 바이알용 스크류 캡, DN9 | Dr. R. Forche 크로마토그래피 | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| 쇼트 스레드 유리 바이알 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche 크로마토그래피 | VT1100309 | |
| 아지드화나트륨(NaN3) | Roth | K305.1 | |
| 수산화나트륨(NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| 인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)VWR | 80731-078 | ||
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker-https://www.bruker.com | ||
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-대칭 디메틸아르기닌 (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
참고문헌
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and w....
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