Entomopatojenik Mantarların, Metarhizium robertsii ve Metarhizium pinghaense'nin Böcek Zararlılarına Karşı Ticari Uygulama İçin Seri Üretimi
Summary
Entomopatojenik mantarlar tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Bu çalışmada, hem Metarhizium robertsii hem de M. pinghaense’nin Güney Afrika izolatlarının yeterli sayıda dirençli enfektif propagülünün böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için seri üretimi, tarımsal tahıl ürünleri kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.
Abstract
Metarhizium anisopliae tür kompleksinin entomopatojenik mantarları, tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Kimyasal böcek öldürücülere karşı haşere direncindeki artış, böcek öldürücülerin insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler ve pestisitlerden kaynaklanan çevre kirliliği, bitki koruma ve haşere kontrolü için yeni sürdürülebilir stratejiler bulmak için küresel bir dürtüye yol açmıştır. Daha önce, Beauveria bassiana gibi entomopatojenik mantar (EPF) türlerini kitle kültürü girişimleri gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, böcek zararlılarına karşı kullanılmak üzere kitle kültürü Metarhizium robertsii ve M. pinghaense’ye sadece sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu çalışmada, M. robertsii ve M. pinghaense’nin Güney Afrika izolatlarının ticari uygulama için yeterli sayıda dirençli enfektif propagusunun seri olarak üretilmesi amaçlanmıştır. EPF katı fermantasyon substratları olarak üç tarımsal tahıl ürünü, pul pul yulaf, pul pul arpa ve pirinç kullanılmıştır. Katı substratları aşılamak için iki aşılama yöntemi, konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanıldı. Konidiyal süspansiyonlar kullanılarak yapılan aşılamanın nispeten daha az etkili olduğu gözlenmiştir, çünkü blastospor aşılama yönteminin kullanılmasına göre katı substratlarda artan kontaminasyon seviyeleri gözlenmiştir. Pul yulafın hem M. robertsii hem de M. pinghaense için uygun bir büyüme substratı olmadığı bulunmuştur, çünkü substrattan kuru konidia toplanmamıştır. Çırpılmış arpanın M. robertsii conidia’nın üretimini M. pinghaense’ninkine tercih ettiği bulundu ve substrattan ortalama 1.83 g ± 1.47 g kuru M. robertsii conidia ve sıfır gram M. pinghaense conidia toplandı. Pirinç tanelerinin, hem M. pinghaense hem de M. robertsii izolatlarının konidiyal seri üretimini desteklediği, sırasıyla substrattan toplanan ortalama 8.2 g ± 4.38 g ve 6 g ± 2 g olduğu bulunmuştur.
Introduction
Entomopatojenik mantarlar (EPF), önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolünde bitki koruma ajanları olarak önem kazanmıştır 1,2. Toprakta doğal olarak bulunan entomopatojenler, çeşitli haşere türlerinin popülasyonlarında epizootiklere nedenolur 3. EPF türleri konakçıya özgüdür ve hedef olmayan türlere saldırma açısından nispeten az risk oluşturur ve çevre için toksik değildirler4. EPF, konakçılarını istila etmek ve yakın çevrelerinde yaymak ve kalıcı olmak için benzersiz bir mekanizmaya sahiptir1. Konağa esas olarak, konakçı hemokolunda istila etmek ve çoğalmak için konakçı kütikülüne bağlanan ve nüfuz eden aseksüel sporlar yoluyla saldırırlar. Konakçı sonunda hemolenf besin maddelerinin tükenmesi nedeniyle veya mantar tarafından salınan toksik metabolitlerin neden olduğu tokseminin bir sonucu olarak ölür. Ölümü takiben, ideal çevre koşullarında, mantar konakçı kadavranın dış yüzeyinde (açık mikoz)ortaya çıkar 5,6.
Kimyasal kalıntıların insan sağlığı, çevre kirliliği ve haşere direncinin gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler, kimyasal bazlı böcek öldürücülerin girdilerini azaltma ve mahsul koruma ve haşere kontrolü için alternatif, yeni ve sürdürülebilir stratejiler bulma yönündeki küresel dürtüye yol açmıştır 6,7,8 . Bu, geleneksel kimyasal kontrolden daha ekolojik olarak elverişli stratejiler olan Entegre Haşere Yönetimi (IPM) programlarında kullanılmak üzere mikrobiyal bazlı insektisitler geliştirme fırsatları sağlamıştır 3,8.
Bir tarımsal haşere için başarılı bir mikrobiyal kontrol ajanı geliştirmek için, önce uygun bir organizma izole edilmeli, karakterize edilmeli, tanımlanmalı ve hedef haşere için patojenitesi doğrulanmalıdır. Bununla birlikte, biyolojik kontrol programlarında kullanılmak üzere uygun bir ürün üretmek için mikrobiyal maddenin büyük ölçekli üretimi için kolay, uygun maliyetli bir yöntem gereklidir 9,10,11,12,13. Önemli miktarlarda kaliteli entomopatojenlerin seri üretimi, mikrobiyal suşa, çevreye, hedef zararlıya, formülasyona, pazara, uygulama stratejisine ve istenen son ürüne bağlıdır14,15,16. EPF, blastosporlar üretmek için sıvı substrat fermantasyonu veya hava konidia 6,17,18 üretmek için katı substrat fermantasyon işlemi kullanılarak seri olarak üretilebilir. Bununla birlikte, entomopatojenlerin seri üretim ve formülasyon süreci, nihai ürünün virülansı, maliyeti, raf ömrünü ve saha etkinliğini doğrudan etkiler. IPM’de başarılı bir şekilde kullanılması için, entomopatojenlerin üretim sürecinin çalıştırılması kolay olmalı, minimum emek gerektirmeli, yüksek verimli virülan, canlı ve kalıcı propagules konsantrasyonu üretmeli ve düşük maliyetliolmalıdır 4,13,14,16.
Entomopatojenlerin beslenme gereksinimlerinin anlaşılması, tüm kültürleme yöntemleriyle kitle ekimi için önemlidir 4,12. Üretim ortamının besin bileşenleri, biyokontrol etkinliği, verim, kuruma toleransı ve kalıcılık 8,19,20,21 dahil olmak üzere ortaya çıkan propagüllerin özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Üretim prosedürlerinin optimizasyonu bu faktörleri ele almak için tasarlanmıştır22. EPF için, iyi büyüme, sporülasyon ve mantar konidiasının seri üretimi için temel gereksinimler yeterli nem, optimum büyüme sıcaklığı, pH, CO2 ve O2’nin gaz değişimi ve iyi fosfor, karbonhidrat, karbon ve azot kaynakları dahil olmak üzere beslenmedir18.
Jaronski ve Jackson18, katı substrat fermantasyon yöntemini, sıvı substrat fermantasyon yöntemine göre EPF üretimi için doğal prosese en verimli ve en yakın yaklaşım yöntemi olarak tanımlamaktadır, çünkü doğal koşullar altında, mantar konidiyumu, böcek kadavralarının yüzeyi gibi katı dik yapılar üzerinde doğar. Tarımsal ürünler ve nişasta içeren yan ürünler çoğunlukla hipokrealli mantarların seri üretimi için kullanılır, çünkü mantarlar nişastayı hifal uçlarından yüksek konsantrasyonlu hidrolitik enzimlerin salgılanması, katı maddeye nüfuz etmesi ve maddede bulunan besin maddelerine erişmesi yoluyla kolayca ayrışırlar11,17,18,23 . Tahıl ürünleri aynı zamanda sağlıklı biyokütle üretimi için gereksinimleri de sağlar, çünkü hidratlandıklarında ve sterilize edildiklerinde, substratlar herhangi bir sıvı ortamdan daha fazla besin maddesini emebilir16,18,24.
Daha önce, birkaç çalışma Beauveria bassiana (Bals.) gibi EPF türlerini kitle kültürüne çalıştı. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas ve Metarhizium anisopliae’nin bir kısmı (Metschn.) Sorokin türleri kompleksi çeşitli substratlar üzerinde izolatlar 16,23,24. Bu tür seri üretilen ve ticari olarak geliştirilen izolatlar arasında M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 suşu ICIPE69) ve M. anisopliae’den geliştirilen Real Metarhizium 69 (L9281) ve B. bassiana25,26’dan geliştirilen Broadband® (suş PPRI 5339) ve Eco-Bb’den geliştirilen Yeşil Kas® (suş IMI 330189) ve Eco-Bb® bulunmaktadır. . Bununla birlikte, kitle kültürü Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber ve Metarhizium pinghaense Chen & Guo’ya sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu iki izolat, önceki bir çalışmada, mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27’nin kontrolünde en etkili olarak seçilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma, böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için M. robertsii ve M. pinghaense’nin yerel izolatlarının yeterli sayıda esnek enfektif propagülünün formüle edilmesini ve seri olarak üretilmesini amaçlamıştır. Katı substrat fermantasyon yöntemi, her iki EPF izolatı için mantar konidiasını seri üretmek için kullanıldı. Katı substratları aşılamak için konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanılarak iki EPF aşılama yöntemi kullanıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolü için mikrobiyal ajanların bir agroekosisteme başarılı bir şekilde entegre edilmesi, laboratuvar koşullarında ilk adım olarak entomopatojenlerin hem başarısına hem de seri üretiminin kolaylığına bağlıdır. EPF’nin seri üretimi, biyolojik kontrol 9,10,11,12,13 kullanan IPM programları için EPF ürünlerinin büyük ölçekli …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, projeyi finanse ettikleri için Hort Pome, Hort Stone ve Endüstri için Teknoloji ve İnsan Kaynakları Programı’na (THRIP: TP14062571871) teşekkür eder.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D’Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).
