체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링
Summary
본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.
Abstract
비표준 Wnt 신호 전달은 배아 발생 동안 세포 내 액틴 필라멘트 조직 및 전구 세포의 분극 이동을 조절합니다. 이 프로세스에는 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 복잡하고 조정된 파라크린 상호 작용이 필요합니다. 이러한 상호 작용이 서로 다른 계통의 다양한 유형의 세포 간에 발생할 수 있다는 점을 감안할 때 세포 특이적 결함의 생체 내 평가는 어려울 수 있습니다. 본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호전달을 평가하기 위한 고도로 재현성 있는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 (1) 관심있는 두 세포 유형 사이에서 비표준 Wnt 신호 전달의 기능적 및 분자 평가를 수행하는 능력으로 설계되었습니다. (2) 비표준 Wnt 신호 전달 경로에서 신호 전송 대 신호 수신 분자의 역할을 해부합니다. (3) 표준 분자 또는 약리학적 접근으로 표현형 구조 실험을 수행합니다.
이 프로토콜은 근모세포에서 신경 볏 세포(NCC) 매개 비표준 Wnt 신호 전달을 평가하는 데 사용되었습니다. NCC의 존재는 근아세포에서 팔로이딘 양성 세포질 필로포디아 및 라멜리포디아의 증가와 상처 치유 분석에서 개선된 근세포 이동과 관련이 있습니다. Wnt5a-ROR2 축은 NCC와 제 2 심장 필드 (SHF) 심근 세포 전구 세포 사이의 중요한 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 확인되었습니다. 결론적으로, 이것은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 메커니즘을 연구하기 위한 매우 다루기 쉬운 프로토콜입니다.
Introduction
비표준 Wnt 신호 전달은 세포 필라멘트 조직과 방향 이동을 조절하는 진화적으로 보존된 경로입니다. 이 경로는 배아 조직 형태 형성 1,2,3, 림프 및 혈관 신생 4,5,6,7, 암 성장 및 전이 8,9,10을 포함한 여러 생물학적 과정과 관련이 있습니다. . 세포 수준에서 비표준 Wnt 신호 전달은 신호 송신 세포와 신호 수신 세포 간의 조정된 파라크린 상호 작용을 통해 수행됩니다. 이러한 상호작용은 상이한 계통 또는 유형의 세포 사이에서 빈번하게 발생하며, 최대 19개의 리간드 및 다중 수용체, 공동-수용체 및 다운스트림 신호 전달 이펙터(11)를 포함하는 다양한 분자 네트워크를 포함한다. 이러한 신호전달 과정을 더욱 복잡하게 만드는 것은 이전 연구에서 리간드-수용체 조합이 문맥 및 조직 의존적 방식으로 다양할 수 있으며12,13, 신호 수신 세포에서 비표준 Wnt 신호전달을 유도하는 동일한 소스 리간드가 여러 신호 전달 세포 유형에 의해 생성될 수 있음을 보여주었습니다.14,15 . 비표준 Wnt 신호 전달과 관련된 세포 및 분자 복잡성을 감안할 때 생체 내에서 개별 및 임상적으로 관련된 메커니즘을 연구하는 능력은 제한적이었습니다.
시험관 내에서 세포 배양 기술을 사용하여 비표준 Wnt 신호 전달을 연구하려는 시도가 있었습니다. 예를 들어, 세포 단층에서 수행된 상처-치유 분석은 세포 방향 이동 4,16,17,18,19를 기능적으로 평가하기 위해 사용되었다. 면역염색 기술은 세포 형태 7,10, 아키텍처및 비대칭 편광(18,19,20)에서 비표준 Wnt 유도 변화를 평가하기 위해 표면 단백질 발현의 공간 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 이러한 접근법이 신호 수신 세포에서 Wnt 관련 표현형을 특성화하는 데 중요한 도구를 제공했지만, 이러한 프로토콜에 신호 전달 성분이 없기 때문에 생체 내에서 관찰되는 파라 크린 신호 전달 메커니즘을 정확하게 모델링하는 능력이 제한됩니다. 결과적으로, 비표준 Wnt 경로의 신호 송신 및 수신 세포, 특히 다른 세포 유형의 세포 간의 파라크린 신호 상호 작용에 대한 강력하고 재현 가능한 평가를 허용하는 시험관 내 시스템을 개발할 중요한 필요성이 남아 있습니다.
이를 위해, 본 연구의 주요 목적은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 상호작용을 모델링하기 위한 프로토콜을 확립하는 것이었다. 우리는 이러한 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 요약하고 표준 분자, 유전 적 또는 약리학 적 접근법을 사용하여 비표준 Wnt 경로에서 특정 리간드 수용체 메커니즘을 독립적으로 연구 할 수있는 비접촉 공동 배양 시스템을 개발했습니다. NCC 매개 Wnt 신호 전달의 메커니즘은 확립 된 쥐 세포주를 사용하여 근세포 세포에서 조사되었습니다. 원리의 증거로서, 이 모델은 Wnt5a-ROR2 축을 NCC 21과 SHF 심근세포 전구세포 전구세포 3,22,23 사이의 관련 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 암시하는 마우스에서의 이전 생체내 연구 결과를 확증하는 데 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비표준 Wnt/평면 세포 극성(PCP) 신호 전달 경로는 다중 발달 24,25 및 질병 과정24,26과 관련된 매우 중요한 세포 신호 전달 경로입니다. 배아 발달 동안, 비표준 Wnt 신호전달은 신호-수신 세포(11)에서 형태, 비대칭 조직 및 방향 이동의 변화를 궁극적으로 유도하는 신호-송신 세포로부터의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 상 F30HL154324를 O.T.에, K08HL121191 및 R03HL154301을 S.R.K.에 부분적으로 지원했습니다. 저자는 이 원고의 그림 1 에 있는 도식이 biorender.com 로 작성되었음을 인정하고자 합니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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