النمذجة Paracrine إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر
Summary
تحدد الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة لدراسة أحداث إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تطبيق هذا البروتوكول لتقييم تأثير إشارات باراكرين Wnt5a في خلايا القمة العصبية للفئران والأرومات العضلية.
Abstract
تنظم إشارات Wnt غير المتعارف عليها تنظيم خيوط الأكتين داخل الخلايا والهجرة المستقطبة للخلايا السلفية أثناء التطور الجنيني. تتطلب هذه العملية تفاعلات باراكرين معقدة ومنسقة بين خلايا إرسال الإشارات وخلايا استقبال الإشارات. بالنظر إلى أن هذه التفاعلات يمكن أن تحدث بين أنواع مختلفة من الخلايا من سلالات مختلفة ، فإن التقييم في الجسم الحي للعيوب الخاصة بالخلية يمكن أن يكون صعبا. تصف الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تصميم هذا البروتوكول مع القدرة على (1) إجراء تقييمات وظيفية وجزيئية لإشارات Wnt غير المتعارف عليها بين أي نوعين من الخلايا ذات الأهمية. (2) تشريح دور جزيئات إرسال الإشارات مقابل جزيئات استقبال الإشارات في مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه ؛ و (3) إجراء تجارب إنقاذ النمط الظاهري باستخدام الأساليب الجزيئية أو الدوائية القياسية.
تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها بوساطة خلية القمة العصبية (NCC) في الأرومات العضلية. يرتبط وجود NCCs بزيادة عدد الفيلوبوديا السيتوبلازمية الإيجابية للقضيب والصفيحيات في الأرومات العضلية وتحسين هجرة الأرومة العضلية في مقايسة التئام الجروح. تم تحديد محور Wnt5a-ROR2 على أنه مسار إشارات Wnt غير قانوني حاسم بين NCC وأسلاف الأرومة العضلية القلبية في مجال القلب الثاني (SHF). في الختام ، هذا بروتوكول قابل للتتبع للغاية لدراسة آليات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر.
Introduction
إشارات Wnt غير المتعارف عليها هي مسار محفوظ تطوريا ينظم تنظيم الخيوط الخلوية والهجرة الاتجاهية. وقد تورط هذا المسار في عمليات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك تشكل الأنسجة الجنينية1،2،3 ، وتكوين الأوعية الدموية اللمفاوية والأوعية الدموية4،5،6،7 ، ونمو السرطان وورم خبيث8،9،10 . على المستوى الخلوي ، يتم تنفيذ إشارات Wnt غير المتعارف عليها من خلال تفاعلات paracrine المنسقة بين خلايا إرسال الإشارات واستقبال الإشارات. تحدث هذه التفاعلات بشكل متكرر بين الخلايا من سلالات أو أنواع مختلفة وتتضمن شبكة جزيئية متنوعة تشمل ما يصل إلى 19 رابطا ومستقبلات متعددة ومستقبلات مشتركة ومستجيبات نقل إشارة المصب11. ومما يزيد من تعقيد عملية الإشارات هذه ، أظهرت الدراسات السابقة أن مجموعات مستقبلات الرباط يمكن أن تختلف بطريقة تعتمد على السياق والأنسجة 12,13 ، وأن نفس روابط المصدر التي تقود إشارات Wnt غير المتعارف عليها في خلايا استقبال الإشارة يمكن إنتاجها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا المرسلة للإشارات 14,15 . نظرا للتعقيد الخلوي والجزيئي المرتبط بإشارات Wnt غير المتعارف عليها ، كانت القدرة على دراسة الآليات الفردية وذات الصلة سريريا في الجسم الحي محدودة.
بذلت محاولات لدراسة إشارات Wnt غير المتعارف عليها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا في المختبر. على سبيل المثال ، تم استخدام فحوصات التئام الجروح التي يتم إجراؤها في أحاديات الطبقة الخلوية لتقييم الهجرة الاتجاهية الخلويةوظيفيا 4،16،17،18،19. تم استخدام تقنيات التلوين المناعي لإجراء تحليلات مكانية لتعبير البروتين السطحي لتقييم التغيرات غير المتعارف عليها Wnt في التشكل الخلوي7،10 ، والهندسة المعمارية ، والاستقطاب غير المتماثل18،19،20. على الرغم من أن هذه الأساليب قد وفرت أدوات مهمة لتوصيف الأنماط الظاهرية المرتبطة ب Wnt في خلايا استقبال الإشارات ، إلا أن عدم وجود مكونات إرسال إشارة في هذه البروتوكولات يحد من قدرتها على نمذجة آليات إشارات paracrine بدقة والتي لوحظت في الجسم الحي. نتيجة لذلك ، لا تزال هناك حاجة ماسة لتطوير أنظمة في المختبر تسمح بإجراء تقييم قوي وقابل للتكرار لتفاعلات إشارات paracrine بين خلايا إرسال الإشارات وتلقيها لمسار Wnt غير المتعارف عليه ، لا سيما تلك الخاصة بأنواع الخلايا المختلفة.
تحقيقا لهذه الغاية ، كان الهدف الأساسي من هذه الدراسة هو إنشاء بروتوكول لنمذجة تفاعلات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. لقد طورنا نظام زراعة مشتركة غير متصل يلخص مكونات إرسال الإشارات واستقبال الإشارات لهذه التفاعلات ويسمح باستخدام الأساليب الجزيئية أو الجينية أو الدوائية القياسية لدراسة آليات مستقبلات الليجند المحددة بشكل مستقل في مسار Wnt غير القانوني. تم فحص آليات إشارات Wnt بوساطة NCC في الأرومات العضلية باستخدام خطوط خلايا الفئران الثابتة. كدليل على المبدأ ، تم استخدام هذا النموذج لتأكيد نتائج الدراسات السابقة في الجسم الحي في الفئران التي تورط محور Wnt5a-ROR2 كمسار إشارات Wnt غير قانوني ذي صلة بين NCCs21 وأسلاف الأرومة العضلية القلبيةSHF 3،22،23.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد مسار إشارات Wnt / قطبية الخلية المستوية (PCP) غير المتعارف عليه مسارا للإشارات الخلوية مهما للغاية وقد تورط في عمليات تنموية متعددة 24,25 ومرض24,26. أثناء التطور الجنيني ، تتضمن إشارات Wnt غير المتعارف عليها شبكة موسعة من الإش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F30HL154324 إلى O.T. و K08HL121191 و R03HL154301 إلى SRK. يود المؤلفون أن يعترفوا بأن المخطط في الشكل 1 في هذه المخطوطة تم إنشاؤه باستخدام biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
