Modellering af parakrine ikke-kanonisk Wnt-signalering in vitro
Summary
Denne undersøgelse skitserer en meget reproducerbar og medgørlig metode til at studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalhændelser in vitro. Denne protokol blev anvendt til at evaluere virkningen af parakrin Wnt5a-signalering i murine neurale kamceller og myoblaster.
Abstract
Ikke-kanonisk Wnt-signalering regulerer intracellulær actinfilamentorganisation og polariseret migration af stamceller under embryogenese. Denne proces kræver komplekse og koordinerede parakrine interaktioner mellem signalafsendende og signalmodtagende celler. I betragtning af at disse interaktioner kan forekomme mellem forskellige typer celler fra forskellige slægter, kan in vivo-evaluering af cellespecifikke defekter være udfordrende. Denne undersøgelse beskriver en meget reproducerbar metode til evaluering af parakrin noncanonical Wnt-signalering in vitro. Denne protokol blev designet med evnen til at (1) udføre funktionelle og molekylære vurderinger af ikke-kanonisk Wnt-signalering mellem to celletyper af interesse; (2) dissekere rollen som signalafsendende versus signalmodtagende molekyler i den ikke-kanoniske Wnt-signalvej; og (3) udføre fænotypiske redningseksperimenter med standard molekylære eller farmakologiske tilgange.
Denne protokol blev brugt til at evaluere neural crest cell (NCC) -medieret noncanonical Wnt-signalering i myoblaster. Tilstedeværelsen af NCC’er er forbundet med et øget antal phalloidin-positive cytoplasmatiske filopodier og lamellipodia i myoblaster og forbedret myoblastmigration i et sårhelende assay. Wnt5a-ROR2-aksen blev identificeret som en afgørende ikke-kanonisk Wnt-signalvej mellem NCC og anden hjertefelt (SHF) cardiomyoblast-forfædre. Afslutningsvis er dette en meget medgørlig protokol til undersøgelse af parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Ikke-kanonisk Wnt-signalering er en evolutionært bevaret vej, der regulerer cellulær filamentorganisation og retningsbestemt migration. Denne vej har været impliceret i flere biologiske processer, herunder embryonal vævsmorfogenese 1,2,3, lymfatisk og vaskulær angiogenese 4,5,6,7 og kræftvækst og metastase 8,9,10 . På celleniveau udføres ikke-kanonisk Wnt-signalering gennem koordinerede parakrine interaktioner mellem signalafsendende og signalmodtagende celler. Disse interaktioner forekommer ofte mellem celler af forskellige afstamninger eller typer og involverer et forskelligt molekylært netværk, der inkluderer op til 19 ligander og flere receptorer, co-receptorer og downstream signaltransduktionseffektorer11. Yderligere komplicerer denne signalproces tidligere undersøgelser har vist, at ligand-receptorkombinationer kan variere på en kontekst- og vævsafhængig måde 12,13, og at de samme kildeligander, der driver ikke-kanonisk Wnt-signalering i signalmodtagende celler, kan produceres af flere signalafsendende celletyper 14,15 . I betragtning af den cellulære og molekylære kompleksitet, der er forbundet med ikke-kanonisk Wnt-signalering, har evnen til at studere individuelle og klinisk relevante mekanismer in vivo været begrænset.
Der er gjort forsøg på at studere ikke-kanonisk Wnt-signalering ved hjælp af cellekulturteknikker in vitro. For eksempel er sårhelende assays udført i cellulære monolag blevet brugt til funktionelt at vurdere cellulær retningsbestemt migration 4,16,17,18,19. Immunostaining teknikker er blevet brugt til at udføre rumlige analyser af overfladeproteinekspression for at evaluere ikke-kanoniske Wnt-inducerede ændringer i cellulær morfologi 7,10, arkitektur og asymmetrisk polarisering18,19,20. Selvom disse tilgange har givet vigtige værktøjer til karakterisering af Wnt-relaterede fænotyper i signalmodtagende celler, begrænser manglen på signalafsendende komponenter i disse protokoller deres evne til nøjagtigt at modellere parakrine signalmekanismer observeret in vivo. Som følge heraf er der fortsat et kritisk behov for at udvikle in vitro-systemer, der muliggør robust og reproducerbar evaluering af parakrine signalinteraktioner mellem signalafsendende og modtagende celler i den ikke-kanoniske Wnt-vej, især dem af forskellige celletyper.
Til dette formål var det primære formål med denne undersøgelse at etablere en protokol til modellering af parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalinteraktioner in vitro. Vi udviklede et ikke-kontakt kokultursystem, der rekapitulerer signalafsendende og signalmodtagende komponenter i disse interaktioner og tillader brug af standard molekylære, genetiske eller farmakologiske tilgange til uafhængigt at studere specifikke ligandreceptormekanismer i den ikke-kanoniske Wnt-vej. Mekanismer for NCC-medieret Wnt-signalering blev undersøgt i myoblaster ved hjælp af etablerede murincellelinjer. Som bevis for princippet blev denne model brugt til at bekræfte fund af tidligere in vivo-undersøgelser på mus, der implicerer Wnt5a-ROR2-aksen som en relevant ikke-kanonisk Wnt-signalvej mellem NCC’er 21 og SHF-kardiomyoblast-forfædre 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den noncanonical Wnt / planar cell polarity (PCP) signalvej er en kritisk vigtig cellulær signalvej, der har været impliceret i flere udviklingsmæssige 24,25 og sygdomsprocesser 24,26. Under embryonal udvikling involverer ikke-kanonisk Wnt-signalering et ekspansivt netværk af molekylære signaler fra signalsendende celler, der i sidste ende inducerer ændringer i morfologi, asymmetrisk organi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH-priser F30HL154324 til O.T. og K08HL121191 og R03HL154301 til S.R.K. Forfatterne vil gerne anerkende, at skemaet i figur 1 i dette manuskript blev oprettet med biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
