Modélisation de la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro
Summary
La présente étude décrit une méthode hautement reproductible et traitable pour étudier in vitro les événements paracrines non canoniques de signalisation Wnt. Ce protocole a été appliqué pour évaluer l’impact de la signalisation paracrine Wnt5a dans les cellules de la crête neurale murine et les myoblastes.
Abstract
La signalisation Wnt non canonique régule l’organisation intracellulaire du filament d’actine et la migration polarisée des cellules progénitrices au cours de l’embryogenèse. Ce processus nécessite des interactions paracrines complexes et coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Étant donné que ces interactions peuvent se produire entre différents types de cellules de différentes lignées, l’évaluation in vivo des défauts spécifiques aux cellules peut être difficile. La présente étude décrit une méthode hautement reproductible pour évaluer la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro. Ce protocole a été conçu avec la capacité de (1) mener des évaluations fonctionnelles et moléculaires de la signalisation Wnt non canonique entre deux types de cellules d’intérêt; (2) disséquer le rôle des molécules émettrices de signaux par rapport aux molécules réceptrices de signaux dans la voie de signalisation Wnt non canonique; et (3) effectuer des expériences de sauvetage phénotypique avec des approches moléculaires ou pharmacologiques standard.
Ce protocole a été utilisé pour évaluer la signalisation Wnt non canonique médiée par les cellules de la crête neurale (NCC) dans les myoblastes. La présence de NCC est associée à une augmentation du nombre de filopodies cytoplasmiques et de lamellipodes phalloïdines positives dans les myoblastes et à une amélioration de la migration des myoblastes dans un test de cicatrisation. L’axe Wnt5a-ROR2 a été identifié comme une voie de signalisation Wnt non canonique cruciale entre la NCC et les progéniteurs de cardiomyoblastes du deuxième champ cardiaque (SHF). En conclusion, il s’agit d’un protocole très facile à traiter pour étudier les mécanismes de signalisation Wnt paracrines non canoniques in vitro.
Introduction
La signalisation Wnt non canonique est une voie conservée de manière évolutive qui régule l’organisation des filaments cellulaires et la migration directionnelle. Cette voie a été impliquée dans de multiples processus biologiques, y compris la morphogenèse des tissus embryonnaires 1,2,3, l’angiogenèse lymphatique et vasculaire 4,5,6,7, et la croissance du cancer et les métastases 8,9,10 . Au niveau cellulaire, la signalisation Wnt non canonique est réalisée par le biais d’interactions paracrines coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Ces interactions se produisent fréquemment entre des cellules de lignées ou de types différents et impliquent un réseau moléculaire diversifié qui comprend jusqu’à 19 ligands et plusieurs récepteurs, corécepteurs et effecteurs de transduction du signal en aval11. Pour compliquer davantage ce processus de signalisation, des études antérieures ont montré que les combinaisons ligand-récepteur peuvent varier d’une manière dépendante du contexte et des tissus 12,13, et que les mêmes ligands sources qui conduisent la signalisation Wnt non canonique dans les cellules réceptrices de signaux peuvent être produits par plusieurs types de cellules émettrices de signaux 14,15 . Compte tenu de la complexité cellulaire et moléculaire associée à la signalisation Wnt non canonique, la capacité d’étudier des mécanismes individuels et cliniquement pertinents in vivo a été limitée.
Des tentatives ont été faites pour étudier la signalisation Wnt non canonique en utilisant des techniques de culture cellulaire in vitro. Par exemple, des essais de cicatrisation effectués dans des monocouches cellulaires ont été utilisés pour évaluer fonctionnellement la migration directionnellecellulaire 4,16,17,18,19. Des techniques d’immunomarquage ont été utilisées pour effectuer des analyses spatiales de l’expression des protéines de surface afin d’évaluer les changements non canoniques induits par Wnt dans la morphologie cellulaire 7,10, l’architecture et la polarisation asymétrique18,19,20. Bien que ces approches aient fourni des outils importants pour caractériser les phénotypes liés au Wnt dans les cellules réceptrices de signaux, l’absence de composants d’envoi de signaux dans ces protocoles limite leur capacité à modéliser avec précision les mécanismes de signalisation paracrine observés in vivo. En conséquence, il reste un besoin critique de développer des systèmes in vitro qui permettent une évaluation robuste et reproductible des interactions de signalisation paracrine entre les cellules émettrices et réceptrices de la voie Wnt non canonique, en particulier celles de différents types de cellules.
À cette fin, l’objectif principal de cette étude était d’établir un protocole pour modéliser les interactions paracrines non canoniques de signalisation Wnt in vitro. Nous avons développé un système de coculture sans contact qui récapitule les composants d’envoi et de réception de signaux de ces interactions et permet l’utilisation d’approches moléculaires, génétiques ou pharmacologiques standard pour étudier indépendamment les mécanismes ligand-récepteur spécifiques dans la voie Wnt non canonique. Les mécanismes de signalisation Wnt médiée par NCC ont été examinés dans des myoblastes utilisant des lignées cellulaires murines établies. Comme preuve de principe, ce modèle a été utilisé pour corroborer les résultats d’études in vivo antérieures chez la souris qui impliquent l’axe Wnt5a-ROR2 comme voie de signalisation Wnt non canonique pertinente entre les NCC 21 et les progéniteurs de cardiomyoblastesSHF 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La voie de signalisation non canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) est une voie de signalisation cellulaire d’une importance critique qui a été impliquée dans de multiples processus de développement 24,25 et de maladie24,26. Au cours du développement embryonnaire, la signalisation Wnt non canonique implique un vaste réseau de signaux moléculaires provenant de cellules émettr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les prix F30HL154324 à O.T. et K08HL121191 et R03HL154301 à S.R.K. Les auteurs tiennent à reconnaître que le schéma de la figure 1 de ce manuscrit a été créé avec biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
