Modellering Paracrine Noncanonical Wnt Signalering In Vitro
Summary
Denne studien skisserer en svært reproduserbar og håndterbar metode for å studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalhendelser in vitro. Denne protokollen ble brukt til å evaluere virkningen av parakrin Wnt5a-signalering i murine nevrale kamceller og myoblaster.
Abstract
Ikke-kanonisk Wnt-signalering regulerer intracellulær aktinfilamentorganisasjon og polarisert migrasjon av stamceller under embryogenese. Denne prosessen krever komplekse og koordinerte parakrine interaksjoner mellom signal-sending og signal-mottak celler. Gitt at disse interaksjonene kan forekomme mellom ulike typer celler fra forskjellige linjer, kan in vivo evaluering av cellespesifikke defekter være utfordrende. Denne studien beskriver en svært reproduserbar metode for å evaluere parakrin ikke-kanonisk Wnt-signalering in vitro. Denne protokollen ble utformet med evnen til å (1) gjennomføre funksjonelle og molekylære vurderinger av ikke-kanonisk Wnt-signalering mellom to celletyper av interesse; (2) dissekere rollen som signal-sending versus signal-mottakende molekyler i den ikke-kanoniske Wnt-signalveien; og (3) utføre fenotypiske redningseksperimenter med standard molekylære eller farmakologiske tilnærminger.
Denne protokollen ble brukt til å evaluere nevrale crest cell (NCC)-mediert ikke-kanonisk Wnt-signalering i myoblaster. Tilstedeværelsen av NCC er assosiert med et økt antall phalloidin-positive cytoplasmatiske filopodier og lamellipodier i myoblaster og forbedret myoblastmigrasjon i en sårhelende analyse. Wnt5a-ROR2-aksen ble identifisert som en avgjørende ikke-kanonisk Wnt-signalvei mellom NCC og andre hjertefelt (SHF) kardiomyoblast-forfedre. Avslutningsvis er dette en svært håndterbar protokoll for å studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Noncanonical Wnt signalering er en evolusjonært bevart vei som regulerer cellulær filament organisasjon og retningsbestemt migrasjon. Denne banen har vært involvert i flere biologiske prosesser, inkludert embryonale vevsmorfogenese 1,2,3, lymfatisk og vaskulær angiogenese4,5,6,7, og kreftvekst og metastase 8,9,10 . På mobilnivå utføres ikke-kanonisk Wnt-signalering gjennom koordinerte parakrine interaksjoner mellom signalsendings- og signalmottaksceller. Disse interaksjonene forekommer ofte mellom celler av forskjellige avstamninger eller typer og involverer et mangfoldig molekylært nettverk som inkluderer opptil 19 ligander og flere reseptorer, co-reseptorer og nedstrøms signaltransduksjonseffektorer11. For ytterligere å komplisere denne signalprosessen, har tidligere studier vist at ligand-reseptorkombinasjoner kan variere på en kontekst- og vevsavhengig måte12,13, og at de samme kildeligandene som driver ikke-kanonisk Wnt-signalering i signalmottaksceller, kan produseres av flere signalsendende celletyper14,15 . Gitt den cellulære og molekylære kompleksiteten forbundet med ikke-kanonisk Wnt-signalering, har evnen til å studere individuelle og klinisk relevante mekanismer in vivo vært begrenset.
Det er gjort forsøk på å studere ikke-kanonisk Wnt-signalering ved hjelp av cellekulturteknikker in vitro. For eksempel har sårhelingsanalyser utført i cellulære monolag blitt brukt til å funksjonelt vurdere cellulær retningsmigrasjon 4,16,17,18,19. Immunostaining-teknikker har blitt brukt til å utføre romlige analyser av overflateproteinuttrykk for å evaluere ikke-kanoniske Wnt-induserte endringer i cellulær morfologi 7,10, arkitektur og asymmetrisk polarisasjon18,19,20. Selv om disse tilnærmingene har gitt viktige verktøy for å karakterisere Wnt-relaterte fenotyper i signalmottaksceller, begrenser mangelen på signalsendingskomponenter i disse protokollene deres evne til nøyaktig å modellere parakrine signalmekanismer observert in vivo. Som et resultat er det fortsatt et kritisk behov for å utvikle in vitro-systemer som tillater robust og reproduserbar evaluering av parakrine signalinteraksjoner mellom signalsende- og mottaksceller i den ikke-kanoniske Wnt-banen, spesielt de av forskjellige celletyper.
Til dette formål var det primære målet med denne studien å etablere en protokoll for å modellere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalinteraksjoner in vitro. Vi utviklet et ikke-kontakt kokultursystem som rekapitulerer signalsendings- og signalmottakskomponenter i disse interaksjonene og tillater bruk av standard molekylære, genetiske eller farmakologiske tilnærminger for uavhengig å studere spesifikke ligandreseptormekanismer i den ikke-kanoniske Wnt-banen. Mekanismer for NCC-mediert Wnt-signalering ble undersøkt i myoblaster ved hjelp av etablerte murincellelinjer. Som prinsippbevis ble denne modellen brukt til å bekrefte funn fra tidligere in vivo-studier hos mus som impliserer Wnt5a-ROR2-aksen som en relevant ikke-kanonisk Wnt-signalvei mellom NCCs 21 og SHF kardiomyoblast forfedre 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ikke-kanoniske Wnt / plane cellepolaritet (PCP) signalveien er en kritisk viktig cellulær signalvei som har vært involvert i flere utviklingsmessige 24,25 og sykdomsprosesser 24,26. Under embryonal utvikling innebærer ikke-kanonisk Wnt-signalering et ekspansivt nettverk av molekylære signaler fra signalsendende celler som til slutt induserer endringer i morfologi, asymmetrisk organisasjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH-tildelinger F30HL154324 til O.T. og K08HL121191 og R03HL154301 til S.R.K. Forfatterne vil gjerne erkjenne at skjemaet i figur 1 i dette manuskriptet ble opprettet med biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
