Modellering Paracrine Noncanonical Wnt Signalering In Vitro
Summary
Den aktuella studien beskriver en mycket reproducerbar och lätthanterlig metod för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signaleringshändelser in vitro. Detta protokoll tillämpades för att utvärdera effekten av parakrin Wnt5a-signalering i murina neurala vapenceller och myoblaster.
Abstract
Icke-kanonisk Wnt-signalering reglerar intracellulär aktinfilamentorganisation och polariserad migration av stamceller under embryogenesen. Denna process kräver komplexa och samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Med tanke på att dessa interaktioner kan uppstå mellan olika typer av celler från olika släktlinjer kan in vivo-utvärdering av cellspecifika defekter vara utmanande. Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att utvärdera parakrin icke-kanonisk Wnt-signalering in vitro. Detta protokoll utformades med förmågan att (1) genomföra funktionella och molekylära bedömningar av icke-kanonisk Wnt-signalering mellan två celltyper av intresse; (2) dissekera rollen av signalsändande kontra signalmottagande molekyler i den icke-kanoniska Wnt-signalvägen; och (3) utföra fenotypiska räddningsexperiment med vanliga molekylära eller farmakologiska metoder.
Detta protokoll användes för att utvärdera neurala crest cell (NCC) -medierade icke-kanoniska Wnt-signalering i myoblaster. Närvaron av NCC är associerad med ett ökat antal falloidinpositiva cytoplasmatiska filopodier och lamellipodier i myoblaster och förbättrad myoblastmigration i en sårläkningsanalys. Wnt5a-ROR2-axeln identifierades som en avgörande icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC och andra hjärtfält (SHF) kardiomyoblastförfäder. Sammanfattningsvis är detta ett mycket lätthanterligt protokoll för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Icke-kanonisk Wnt-signalering är en evolutionärt bevarad väg som reglerar cellulär filamentorganisation och riktningsmigration. Denna väg har varit inblandad i flera biologiska processer, inklusive embryonal vävnadsmorfogenes 1,2,3, lymfatisk och vaskulär angiogenes 4,5,6,7 och cancertillväxt och metastasering 8,9,10 . På cellnivå utförs icke-kanonisk Wnt-signalering genom samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Dessa interaktioner förekommer ofta mellan celler av olika härstamning eller typ och involverar ett varierat molekylärt nätverk som inkluderar upp till 19 ligander och flera receptorer, samreceptorer och nedströms signaltransduktionseffektorer11. För att ytterligare komplicera denna signalprocess har tidigare studier visat att ligand-receptorkombinationer kan variera på ett kontext- och vävnadsberoende sätt 12,13, och att samma källligander som driver icke-kanonisk Wnt-signalering i signalmottagande celler kan produceras av flera signalsändande celltyper 14,15 . Med tanke på den cellulära och molekylära komplexiteten associerad med icke-kanonisk Wnt-signalering har förmågan att studera individuella och kliniskt relevanta mekanismer in vivo varit begränsad.
Försök har gjorts att studera icke-kanonisk Wnt-signalering med hjälp av cellodlingstekniker in vitro. Till exempel har sårläkningsanalyser utförda i cellulära monolager använts för att funktionellt bedöma cellulär riktningsmigration 4,16,17,18,19. Immunfärgningstekniker har använts för att utföra rumsliga analyser av ytproteinuttryck för att utvärdera icke-kanoniska Wnt-inducerade förändringar i cellulär morfologi 7,10, arkitektur och asymmetrisk polarisation18,19,20. Även om dessa tillvägagångssätt har gett viktiga verktyg för att karakterisera Wnt-relaterade fenotyper i signalmottagande celler, begränsar bristen på signalsändande komponenter i dessa protokoll deras förmåga att exakt modellera parakrina signalmekanismer som observerats in vivo. Som ett resultat kvarstår ett kritiskt behov av att utveckla in vitro-system som möjliggör robust och reproducerbar utvärdering av parakrina signalinteraktioner mellan signalsändande och mottagande celler i den icke-kanoniska Wnt-vägen, särskilt de av olika celltyper.
För detta ändamål var det primära målet med denna studie att upprätta ett protokoll för att modellera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalinteraktioner in vitro. Vi utvecklade ett kontaktfritt kokultursystem som rekapitulerar signalsändande och signalmottagande komponenter i dessa interaktioner och tillåter användning av standard molekylära, genetiska eller farmakologiska metoder för att självständigt studera specifika ligandreceptormekanismer i den icke-kanoniska Wnt-vägen. Mekanismer för NCC-medierad Wnt-signalering undersöktes i myoblaster med hjälp av etablerade murina cellinjer. Som bevis på princip användes denna modell för att bekräfta fynd av tidigare in vivo-studier på möss som implicerar Wnt5a-ROR2-axeln som en relevant icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC 21 och SHF kardiomyoblast stamfäder 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den icke-kanoniska Wnt / planar cellpolaritet (PCP) signalvägen är en kritiskt viktig cellulär signalväg som har varit inblandad i flera utvecklingsprocesser 24,25 och sjukdomsprocesser 24,26. Under embryonal utveckling involverar icke-kanonisk Wnt-signalering ett expansivt nätverk av molekylära signaler från signalsändande celler som i slutändan inducerar förändringar i morfologi, asy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelserna F30HL154324 till OT och K08HL121191 och R03HL154301 till S.R.K. Författarna vill erkänna att schemat i figur 1 i detta manuskript skapades med biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
