Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi
Summary
Bu çalışma, in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal olaylarını incelemek için oldukça tekrarlanabilir ve izlenebilir bir yöntemi özetlemektedir. Bu protokol, parakrin Wnt5a sinyallemesinin murin nöral krest hücrelerinde ve miyoblastlarda etkisini değerlendirmek için uygulandı.
Abstract
Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, embriyogenez sırasında hücre içi aktin filament organizasyonunu ve progenitör hücrelerin polarize göçünü düzenler. Bu süreç, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasında karmaşık ve koordineli parakrin etkileşimler gerektirir. Bu etkileşimlerin farklı soylardan çeşitli hücre tipleri arasında meydana gelebileceği göz önüne alındığında, hücreye özgü kusurların in vivo değerlendirilmesi zor olabilir. Bu çalışmada in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) ilgilenilen herhangi iki hücre tipi arasında kanonik olmayan Wnt sinyallemesinin fonksiyonel ve moleküler değerlendirmelerini yapma yeteneği ile tasarlanmıştır; (2) kanonik olmayan Wnt sinyal yolundaki sinyal gönderen ve sinyal alan moleküllerin rolünü incelemek; ve (3) standart moleküler veya farmakolojik yaklaşımlarla fenotipik kurtarma deneyleri yapmak.
Bu protokol, miyoblastlarda nöral krest hücresi (NCC) aracılı kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için kullanıldı. NCC’lerin varlığı, miyoblastlarda artan sayıda faloidin-pozitif sitoplazmik filopodi ve lamellipodi ve yara iyileştirici bir tahlilde miyoblast göçünün artmasıyla ilişkilidir. Wnt5a-ROR2 ekseni, NCC ve ikinci kalp alanı (SHF) kardiyomiyoblast progenitörleri arasında çok önemli bir kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak tanımlandı. Sonuç olarak, bu parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal mekanizmalarını in vitro olarak incelemek için oldukça uzun süreli bir protokoldür.
Introduction
Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, hücresel filament organizasyonunu ve yönlü göçü düzenleyen evrimsel olarak korunmuş bir yoldur. Bu yolak, embriyonik doku morfogenezi 1,2,3, lenfatik ve vasküler anjiyogenez 4,5,6,7 ve kanser büyümesi ve metastazı 8,9,10 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte rol oynamıştır. . Hücresel düzeyde, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasındaki koordineli parakrin etkileşimler yoluyla gerçekleştirilir. Bu etkileşimler sıklıkla farklı soylardan veya tiplerden hücreler arasında meydana gelir ve 19 ligand’a kadar ve çoklu reseptörler, ko-reseptörler ve aşağı akış sinyal iletim efektörleri11’i içeren çeşitli bir moleküler ağı içerir. Bu sinyalleme sürecini daha da karmaşıklaştıran önceki çalışmalar, ligand-reseptör kombinasyonlarının bağlam ve dokuya bağımlı bir şekilde değişebileceğini göstermiştir 12,13 ve sinyal alan hücrelerde kanonik olmayan Wnt sinyalini yönlendiren aynı kaynak ligandları, çoklu sinyal gönderen hücre tipleri tarafından üretilebilir 14,15 . Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler karmaşıklık göz önüne alındığında, in vivo olarak bireysel ve klinik olarak ilgili mekanizmaları inceleme yeteneği sınırlı kalmıştır.
In vitro hücre kültürü tekniklerini kullanarak kanonik olmayan Wnt sinyallemesini incelemek için girişimlerde bulunulmuştur. Örneğin, hücresel monokatmanlarda yapılan yara iyileştirici testler, hücreselyönlü göçü 4,16,17,18,19 olarak işlevsel olarak değerlendirmek için kullanılmıştır. İmmünoboyama teknikleri, hücresel morfoloji 7,10, mimari ve asimetrik polarizasyondaki kanonik olmayan Wnt kaynaklı değişiklikleri değerlendirmek için yüzey protein ekspresyonunun mekansal analizlerini yapmak için kullanılmıştır18,19,20. Bu yaklaşımlar, sinyal alan hücrelerde Wnt ile ilişkili fenotipleri karakterize etmek için önemli araçlar sağlamış olsa da, bu protokollerde sinyal gönderen bileşenlerin eksikliği, in vivo olarak gözlemlenen parakrin sinyal mekanizmalarını doğru bir şekilde modelleme yeteneklerini sınırlar. Sonuç olarak, kanonik olmayan Wnt yolunun sinyal gönderen ve alan hücreleri, özellikle de farklı hücre tiplerindeki hücreler arasındaki parakrin sinyal etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesine izin veren in vitro sistemlerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır.
Bu amaçla, bu çalışmanın temel amacı, parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerini in vitro olarak modellemek için bir protokol oluşturmaktır. Bu etkileşimlerin sinyal gönderme ve sinyal alma bileşenlerini özetleyen ve kanonik olmayan Wnt yolundaki spesifik ligand-reseptör mekanizmalarını bağımsız olarak incelemek için standart moleküler, genetik veya farmakolojik yaklaşımların kullanılmasına izin veren temassız bir kokültür sistemi geliştirdik. NCC aracılı Wnt sinyalizasyonunun mekanizmaları, yerleşik murin hücre hatları kullanılarak miyoblastlarda incelendi. İlkenin kanıtı olarak, bu model, Wnt5a-ROR2 eksenini, NCC’ler 21 ve SHF kardiyomiyoblast progenitörleri 3,22,23 arasındaki ilgili kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak ima eden farelerde yapılan önceki in vivo çalışmaların bulgularını doğrulamak için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanonik olmayan Wnt/düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyal yolu, çoklu gelişimsel 24,25 vehastalık süreçleri 24,26’da rol oynayan kritik öneme sahip bir hücresel sinyal yoludur. Embriyonik gelişim sırasında, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen hücrelerden gelen ve sonuçta morfolojide, asimetrik organizasyonda ve sinyal alan hücrelerde yönlü göçte değişikliklere ned…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F30HL154324 tarafından O.T. ve K08HL121191 ve R03HL154301 S.R.K. tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu makaledeki Şekil 1’deki şemanın biorender.com ile oluşturulduğunu kabul etmek istemektedir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. 발생학. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. 발생학. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. 발생학. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
