Inductie van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode die myocardinfarct of myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen kan induceren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader door middel van micromanipulatie.

Abstract

Acuut myocardinfarct is een veel voorkomende hart- en vaatziekte met een hoge mortaliteit. Myocardreperfusieletsel kan de gunstige effecten van hartreflow tegengaan en secundair myocardletsel veroorzaken. Een eenvoudig en reproduceerbaar model van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel is een goed hulpmiddel voor onderzoekers. Hier wordt een aanpasbare methode beschreven om een myocardinfarct (MI)-model en MIRI te creëren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader (LAD) door middel van micromanipulatie. Nauwkeurige en reproduceerbare ligatuurpositionering van de LAD helpt bij het verkrijgen van consistente resultaten voor hartletsel. Wijzigingen in het ST-segment kunnen helpen om de nauwkeurigheid van het model te identificeren. Het serumniveau van cardiaal troponine T (cTnT) wordt gebruikt om het myocardletsel te beoordelen, cardiale echografie wordt gebruikt om de myocardiale systolische functie te evalueren en Evans-Blue/trifenyltetrazoliumchloride-kleuring wordt gebruikt om de infarctgrootte te meten. Over het algemeen verkort dit protocol de duur van de procedure, zorgt het voor een beheersbare infarctgrootte en verbetert het de overleving van muizen.

Introduction

Acuut myocardinfarct (AMI) is wereldwijd een veel voorkomende hart- en vaatziekte en brengt een hoge mortaliteit met zich^mee1. Technologische vooruitgang maakt vroege en effectieve revascularisatie beschikbaar voor AMI-patiënten. Na deze behandelingen kan bij sommige patiënten myocardischemie-reperfusieletsel (MIRI) optreden². Het is dus van groot belang om de mechanismen van acties te begrijpen en hoe MI/MIRI kan worden verbeterd. Muizen worden veel gebruikt als model vanwege hun lage kosten, snelle voortplantingstijd en het gemak om genetische veranderingen aan te brengen³. Geleerden hebben verschillende methoden ontwikkeld om MIRI en MI te modelleren in dier 4,5,6,7,8,9. Deze strategie bevordert het onderzoek, maar de verschillende criteria en methoden die worden gebruikt, bemoeilijken de interpretatie van de resultaten door onderzoeksteams.

Bij muizen is MI geïnduceerd door isoproterenol¹⁰, cryoletsel ^{11,12 of} cauterisatie¹³. MI kan gemakkelijk worden geïnduceerd door isoproterenol, maar het pathofysiologische proces is anders dan dat bij klinisch MI. Door cryoletsel geïnduceerd MI heeft een slechte consistentie, veroorzaakt overmatige myocardiale schade rond de linker voorste dalende kransslagader (LAD) en kan gemakkelijk aritmie veroorzaken. Cauterisatie-geïnduceerde MI is heel anders dan het natuurlijke proces van een hartinfarct, en de ontstekingsreactie in het brandende gebied is intenser; Bovendien heeft de chirurgische benadering technische problemen. Bovendien zijn er enkele laboratoria¹⁴ die een MI-model ontwikkelen bij minivarkens met behulp van ballonblokkering of embolisatie- of trombosemethode door middel van interventionele techniek. Al deze methoden kunnen direct occlusie van de kransslagader veroorzaken, maar het nodig hebben van coronaire angiografie-apparaten en vooral de te dunne kransslagaders van muizen maakt deze operaties niet praktisch. Voor MIRI waren de verschillen tussen de verschillende modellen vrij bescheiden, zoals het gebruik van ademhalingstoestellen/micromanipulatie of niet ^5,6.

Hier wordt een eenvoudige en betrouwbare methode beschreven die MI en het MIRI-model kan induceren, aangepast van eerder gepubliceerde methoden 4,5,6,7,8,9,15. Deze methode kan pathofysiologische processen simuleren door directe blokkade van de LAD door ligatie. Bovendien kan dit model, door de ligatie te ontlasten, ook reperfusieletsel simuleren. In dit protocol wordt een ontleedmicroscoop gebruikt voor LAD-visualisatie. Vervolgens kan de onderzoeker de LAD gemakkelijk identificeren. Vervolgens leidt nauwkeurige ligatie van de LAD tot reproduceerbare en voorspelbare bloedocclusie en ventriculaire ischemie. Bovendien kunnen veranderingen in elektrocardiografie (ECG) worden gebruikt om ischemie en reperfusie te bevestigen, naast de kleurveranderingen van de LAD die onder een microscoop worden waargenomen. Deze strategie leidt tot een kortere duur van de procedure, een lager risico op chirurgische complicaties en minder experimentele muizen nodig. De methoden voor de troponine-T-test, cardiale echografie en trifenyltetrazoliumchloride (TTC)-kleuring worden ook beschreven. Over het algemeen is dit protocol nuttig voor studies van het MI/MIR-mechanisme, evenals voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Protocol

Dierstudies zijn goedgekeurd door het Animal Care and Utilization Committee van de Huazhong University of Science and Technology (Wuhan, China). OPMERKING: Mannelijke C57BL/6J-muizen (8-10 weken) worden als model gebruikt. Muizen hebben vrije toegang tot voedsel en water en worden gefokt in specifieke pathogeenvrije omstandigheden. De ruimte wordt onder gecontroleerde temperatuur (22 °C ± 2 °C) en vochtigheid (45%-65%) gehouden. Muizen worden blootgesteld aan een 12-uurs licht/donker-omgevi…

Representative Results

De experimentele workflow is weergegeven in figuur 1A. De onderzoeker kan de tijdknooppunten plannen volgens het experimentele ontwerp bij aanvang van het onderzoek. De duur van LAD-ligatie is in overeenstemming met het onderzoeksdoel. Voor MI kan het onderzoek de reperfusiestap negeren. Cardiale echografie is beschikbaar in verschillende stadia van het onderzoek omdat het niet-invasief is, terwijl Evans-Blue/TTC-kleuring alleen kan worden uitgevoerd wanneer de muis wordt geofferd. Voor onde…

Discussion

In de afgelopen jaren heeft de ontwikkeling van modellen voor MI en MIRI in klinisch en wetenschappelijk onderzoek zich snel ontwikkeld^20,21. Er zijn echter nog enkele vragen, zoals de werkingsmechanismen en de manier waarop MI/MIRI kan worden verbeterd, die moeten worden opgelost. Hier wordt een aangepast protocol beschreven voor het opstellen van een muizenmodel van MI en MIRI. Een aantal belangrijke punten moet zorgvuldig worden overwogen.

<p class="jove_c…

Materials

0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		–
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	–
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	–
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	–
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	–
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	–
Depilatory cream	Veet,French		–
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		–
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	–
Evans blue	Sigma,America	E2129	–
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	–
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	–
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	–
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	–
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	–
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	–
Medical alcohol	Huichang ,China		–
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	–
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	–
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	–
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	–
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	–
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	–
PE-10 tube	Huamei,China		–
Pentobarbital	Merck,America	1030001	–
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	–
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	–
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	–
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	–
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	–