Vi presenterar en metod för att utvärdera mikroRNA-uttryck i njure och serum hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion genom kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion.
MikroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som består av 21-25 baser. De översätts inte till proteiner utan arbetar snarare för att hindra funktionen hos deras målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera dem och störa deras översättning. Även om miRNA-uttrycksprofilerna i olika musorgan och vävnader har undersökts har det inte funnits några standardmetoder för att rena och kvantifiera musnjure och serum-miRNA. Vi har etablerat en effektiv och pålitlig metod för att extrahera och utvärdera miRNA-uttrycket i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Metoden använder kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR), och protokollet kräver sex steg: (1) förberedelse av åldrande-accelererad musresistens 1 (SAMR1) möss och åldrande-accelererad musbenägen (SAMP1) möss; 2) extrahera serumprover från dessa möss, (3) extrahera ett njurprov från varje mus; 4) extraktion av totalt RNA (inklusive miRNA) från njur- och serumprover från varje mus, (5) syntesen av komplementärt DNA (cDNA) med omvänd transkription från miRNA; (6) genomföra en qRT-PCR med användning av det erhållna cDNA.
Detta protokoll användes för att bekräfta att, jämfört med kontrollerna, uttrycket av miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p förändrades signifikant i njuren och serumet hos en musmodell med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Detta protokoll klargjorde också förhållandet mellan njure och serum i musmodellen med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Detta protokoll kan användas för att bestämma miRNA-uttryck i njure och serum hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Uttrycket av olika mRNA som spelar viktiga roller i både fysiologi och sjukdom (t.ex. inflammation, fibros, metaboliska störningar och cancer) är känt för att regleras av miRNA, som är korta, icke-kodande RNA som orsakar nedbrytningen och hämmar transkriptionen av mRNA1. Det är därför möjligt att vissa miRNA kan fungera som nya kandidatbiomarkörer och/eller terapeutiska mål för olika sjukdomar 2,3,4,5. Forskning har utförts på miRNA-uttrycksprofiler i en mängd olika musorgan och vävnader (inklusive hjärna6, hjärta7, lunga8, lever9 och njure10). Det finns emellertid inga standardiserade eller etablerade metoder för att extrahera och utvärdera miRNA i njurarna eller serumet hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Därför upprättade vi ett protokoll som kan användas för att på ett tillförlitligt sätt rena och detektera miRNA-uttryck i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Det finns sex huvudsteg i protokollet: (1) beredning av både 50 veckor gamla SAMR1-hanmöss och SAMP1-hanmöss; (2) extraktion av blodprover från den underlägsna vena cava av båda stammarna av möss, med efterföljande användning av ett spitzrör med heparin, följt av centrifugering, för att erhålla ett serumprov; (3) Extraktion av njurprov från möss-A-kiselhomogenisatorn används för att homogenisera njurprovet separat, och provet överförs sedan till ett biopolymerförstöringssystem på en mikrocentrifugspinnkolonn11; 4) Total RNA-extraktion (innehållande miRNA) från serumproverna med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn12 och total RNA-innehållande miRNA-extraktion från njurproverna med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn11. (5) syntes av komplementärt DNA (cDNA) från det totala RNA med användning av omvänt transkriptas, poly(A)polymeras och oligo-dT-primer13,14; och (6) slutligen bestämning av miRNA-uttryck med användning av qRT-PCR och ett interkalerande färgämne13,14.
Detta nya protokoll baserades på studier som lyckades extrahera och utvärdera miRNA i olika typer av vävnad11,12,13. Protokollets biopolymerförstöringssystem visade sig kunna rena högkvalitativt totalt RNA från vävnader11. Noggrannheten och känsligheten hos aspekter av detta protokoll som används för utvärdering av miRNA-uttryck med qRT-PCR med ett interkalerande färgämne har fastställts13,14, till exempel cDNA-syntesen med omvänd transkriptas, poly (A) polymeras och oligo-dT-primers från det extraherade totala RNA. Det nya protokollet har flera fördelar: enkelhet, tidsbesparingar och minskade tekniska fel. Det kan således användas för undersökningar som kräver noggrann och känslig identifiering av njur- och serum-miRNA-profiler. Studier av många patologiska tillstånd kan också använda det nya protokollet.
MiRNA-uttrycksprofilerna hos SAMP1-möss, som är en modell av åldersberoende nedsatt njurfunktion, kan bestämmas enligt nedan. Hos människor är åldersberoende nedsatt njurfunktion associerat med utvecklingen av njursvikt och kännetecknas av både en ökning av området för renal interstitiell fibros och progressionen av glomeruloskleros15,16. Åldersberoende nedsatt njurfunktion är också ett viktigt och frekvent inslag i kronisk njursjukdom och njursjukdom i slutstadiet15,16.
Uttrycksnivåerna för mål-miRNA bestämdes framgångsrikt av det ovan beskrivna protokollet med användning av qRT-PCR. Utvärderingen av de extraherade miRNA är ett viktigt steg för att erhålla meningsfulla qRT-PCR-data. För att bekräfta den adekvata kvaliteten på miRNA innan qRT-PCR utförs, bör spektrofotometri användas för att bestämma förhållandet mellan absorbans vid 260 nm och det vid 280 nm. DNA-kontaminering kan förekomma, och/eller primerdimerer i varje brunn på reaktionsplattan kan förekomma om qRT-PCR inte ger en enda PCR-förstärkning av den förväntade längden och smälttemperaturen, eller om den ger en monomodal smältkurva.
MiRNA-uttrycksnivåer kan utvärderas med flera andra metoder än qRT-PCR, inklusive northern blotting, en mikroarray och ribonukleasskyddsanalyser. QRT-PCR-metoden är dock ett känsligt, exakt, enkelt och reproducerbart förfarande som kräver en mindre provvolym än de som krävs för nordlig blotting och ribonukleasskyddsanalyser19. Eftersom mikroarrayer kan mäta uttrycket av tiotusentals miRNA samtidigt kan de användas för att identifiera kandidat-miRNA-markörer. Microarray-data visar också en hög övergripande korrelation med data som erhållits av qRT-PCR20. Ingen konsensus har dock nåtts om den optimala metoden för att jämföra mikroarraydata som erhållits i olika studier21.
Utvärderingen av serum-miRNA har följande egenskaper. För det första är det lätt att samla serum, och eftersom serum-miRNA är stabila mot frysning och upptining, temperatur och syra kan miRNA vara bra biomarkörer. För det andra finns det hög homologi av miRNA bland arter, och resultaten av djurförsök extrapoleras lätt till människor. För det tredje har serum-miRNA visat potential för användning som terapeutiska läkemedel3. Flera studier har också visat att nivån av uttryck av miRNA i organ är korrelerad med miRNA i serum22,23,24. I den aktuella studien visade miRNA-223-3p, vars njurnivåer inte visade någon signifikant skillnad mellan SAMR1- och SAMP1-mössen, inte heller någon signifikant skillnad mellan stammarna i serumet. Däremot visade miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p, vars njurnivåer visade en signifikant skillnad mellan SAMR1- och SAMP1-mössen, betydande skillnader mellan stammar i serumet.
Detta protokoll har följande begränsningar. För det första har dess användbarhet inte verifierats i andra organ som lever och lunga, och för det andra har den inte testats på andra laboratoriedjur som råttor, hundar och grisar. Flera forskargrupper har använt detta protokoll för rening och detektion av miRNA med qRT-PCR och rapporterat att detta protokoll möjliggjorde rening av högkvalitativt RNA från vävnader och serum 13,14,22,23,24. Denna metod har visat sig ha hög noggrannhet och känslighet för att detektera uttrycket av miRNA 13,14,22,23,24. Den aktuella studiens resultat visar att detta protokoll framgångsrikt kan detektera miRNA-uttryck i serum och njure hos möss. Därför kan protokollet användas för att bestämma serum- och njurmiRNA-uttrycksprofilerna hos möss med olika patologier. På grund av protokollets enkelhet kan ett stort antal prover bearbetas samtidigt. Analyser av uttrycket av många miRNA vid olika patologiska tillstånd i njurarna kan således använda protokollet som beskrivs häri.
Det finns vissa aspekter av protokollet att tänka på. För att undvika nedbrytning av de renade miRNA som skulle inträffa vid rumstemperatur måste miRNA hållas på is. Njurproverna måste homogeniseras tills de är helt upplösta i lysreagenset. Musnjure innehåller en betydande mängd bindväv som är olöslig i lysreagens, och därför krävs en kolonnförstörare för ytterligare homogenisering. Dessutom bör lämpligt endogent kontroll-miRNA (med stabilt uttryck bland proverna) valideras under hela installationen av ett qRT-PCR-experiment. Detta beror på att interferensen av olika ämnen under utförandet av detta protokoll kan förändra uttrycksnivåerna för endogena kontroll-miRNA, vilket kan äventyra resultaten. Sammanfattningsvis beskriver detta papper ett qRT-PCR-protokoll för detektion, rening och utvärdering av miRNA-uttryck i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |