تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ
Summary
استنادا إلى آلية تجميع مركب البروتين INAD ، في هذا البروتوكول ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة Drosophila TRP الذاتية.
Abstract
يعد النقل الضوئي لذبابة الفاكهة أحد أسرع مسارات الإشارات المقترنة ببروتين G المعروفة. لضمان خصوصية وكفاءة هذا الشلال ، ترتبط قناة كاتيون الكالسيوم (Ca2+) القابلة للنفاذ ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) ، بإحكام ببروتين السقالة ، وتعطيل D بدون جهد لاحق (INAD) ، وتشكل مركبا كبيرا من بروتين الإشارات مع كيناز البروتين C (ePKC) الخاص بالعين والفوسفوليباز Cβ / بدون مستقبلات المحتملة A (PLCβ / NORPA). ومع ذلك ، فإن الخصائص البيوكيميائية لقناة ذبابة الفاكهة TRP لا تزال غير واضحة. استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. أولا ، كان جزء الهيستيدين النقي (له) الموسوم NORPA 863-1095 مرتبطا بحبات Ni ويستخدم كطعم لسحب مركب بروتين INAD الداخلي المنشأ من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة. بعد ذلك ، تمت إضافة جزء من الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسوم باسم TRP 1261-1275 إلى حبات Ni للتنافس مع قناة TRP. وأخيرا ، تم فصل قناة TRP في supernatant عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذه الطريقة تجعل من الممكن دراسة آلية بوابة قناة ذبابة الفاكهة TRP من كل من الزوايا الكيميائية الحيوية والهيكلية. يمكن أيضا قياس خصائص الفيزيولوجيا الكهربية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP النقية في المستقبل.
Introduction
النقل الضوئي هو عملية يتم فيها تحويل الفوتونات الممتصة إلى رموز كهربائية للخلايا العصبية. وهو ينقل حصريا الأوبسينات وسلسلة الإشارات التالية المرتبطة ببروتين G في كل من الفقاريات واللافقاريات. في ذبابة الفاكهة ، باستخدام مجالات PDZ الخمسة ، ينظم تعطيل بروتين السقالة – بدون إمكانات لاحقة D (INAD) مجمع إشارات فوق جزيئي ، والذي يتكون من قناة محتملة للمستقبلات العابرة (TRP) ، و phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) ، وكيناز البروتين C (ePKC) (ePKC) 1. يضمن تكوين مجمع الإشارات فوق الجزيئية هذا التوطين الصحيح تحت الخلوي والكفاءة العالية وخصوصية آلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. في هذا المعقد ، تعمل قنوات TRP الحساسة للضوء كمؤثرات في المصب ل NORPA وتتوسط تدفق الكالسيوم وإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية. أظهرت الدراسات السابقة أن فتح قناة ذبابة الفاكهة TRP يتم بوساطة البروتونات ، أو تعطيل بيئة الدهون المحلية ، أو القوة الميكانيكية2،3،4. تتفاعل قناة Drosophila TRP أيضا مع calmodulin5 ويتم تعديلها بواسطة الكالسيوم عن طريق كل من ردود الفعل الإيجابية والسلبية 6,7,8.
حتى الآن ، استندت دراسات الفيزيولوجيا الكهربية على آلية بوابات ذبابة الفاكهة TRP والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) إلى بقع غشاء تم استئصالها ، وتسجيلات الخلايا الكاملة من المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة من النوع البري المنفصل ، والقنوات المعبر عنها بشكل غير متجانس في S2 أو SF9 أو HEK الخلايا2،9،10،11،12،13 ، ولكن ليس على القنوات النقية. كما أن المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP الكاملة الطول لا تزال غير واضحة. من أجل دراسة الخصائص الكهروفسيولوجية للبروتين النقي في بيئة غشائية معاد تشكيلها والحصول على معلومات هيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP كاملة الطول ، فإن الحصول على قنوات TRP كاملة الطول النقية هو الخطوة الأولى الضرورية ، على غرار المنهجيات المستخدمة في دراسات قناة TRP للثدييات14،15،16،17.
في الآونة الأخيرة ، استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD18,19,20 ، تم تطوير استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لأول مرة لتنقية قناة TRP من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة بواسطة حبات الستربتافيدين5. بالنظر إلى السعة المنخفضة والتكلفة الباهظة لخرز الستربتافيدين ، يتم تقديم بروتوكول تنقية محسن هنا يستخدم بروتين الطعم الموسوم والخرز النيفي منخفض التكلفة المقابل بسعة أعلى بكثير. ستساعد الطريقة المقترحة على دراسة آلية بوابات قناة TRP من الزوايا الهيكلية وقياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقناة TRP باستخدام البروتينات النقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD ، الذي يحتوي على خمسة نطاقات PDZ ، هو المنظم الأساسي لآلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن INAD PDZ3 يرتبط بذيل قناة TRP C-terminal مع خصوصية رائعة (KD = 0.3 μM)18. يتفاعل الترادف INAD PDZ45 مع جزء NORPA 863-1095 مع تقارب ربط عال للغاية (KD = 30 nM). وتوفر هذه النتائج أسا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870746) ، ومنح شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20200109140414636) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم 2021A1515010796) إلى W. L. نشكر LetPub (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 신경과학. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
