Oprensning af endogene drosophila transiente receptorpotentialekanaler
Summary
Baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset blev der i denne protokol udviklet en modificeret affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense den endogene Drosophila TRP-kanal.
Abstract
Drosophila fototransduktion er en af de hurtigste kendte G-proteinkoblede signalveje. For at sikre specificiteten og effektiviteten af denne kaskade binder calciumkanalen (Ca2+)-permeabel kationkanal, transient receptorpotentiale (TRP), tæt til stilladsproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD) og danner et stort signalproteinkompleks med øjenspecifik proteinkinase C (ePKC) og phospholipase Cβ/No receptorpotentiale A (PLCβ/NORPA). Imidlertid forbliver de biokemiske egenskaber ved Drosophila TRP-kanalen uklare. Baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset blev der udviklet en modificeret affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense den endogene TRP-kanal. For det første blev det rensede histidin (His) -mærkede NORPA 863-1095-fragment bundet til Ni-perler og brugt som agn til at trække det endogene INAD-proteinkompleks ned fra Drosophila-hovedhomogenater . Derefter blev overdreven renset glutathion S-transferase (GST) -mærket TRP 1261-1275 fragment tilsat til Ni-perlerne for at konkurrere med TRP-kanalen. Endelig blev TRP-kanalen i supernatanten adskilt fra det overdrevne TRP 1261-1275 peptid ved størrelsesekskluderende kromatografi. Denne metode gør det muligt at studere gatingmekanismen for Drosophila TRP-kanalen fra både biokemiske og strukturelle vinkler. De elektrofysiologiske egenskaber af rensede Drosophila TRP-kanaler kan også måles i fremtiden.
Introduction
Fototransduktion er en proces, hvor absorberede fotoner omdannes til elektriske koder for neuroner. Det videresender udelukkende opsiner og den følgende G-proteinkoblede signalkaskade hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr. I Drosophila organiserer stilladsproteininaktivering-no-after-potential D (INAD) ved hjælp af sine fem PDZ-domæner et supramolekylært signalkompleks, som består af en transient receptorpotentiale (TRP) kanal, phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) og øjenspecifik proteinkinase C (ePKC)1. Dannelsen af dette supramolekylære signalkompleks garanterer den korrekte subcellulære lokalisering, høj effektivitet og specificitet af Drosophila fototransduktionsmaskiner. I dette kompleks fungerer lysfølsomme TRP-kanaler som nedstrøms effektorer af NORPA og medierer calciumtilstrømning og depolarisering af fotoreceptorer. Tidligere undersøgelser viste, at åbningen af Drosophila TRP-kanalen medieres af protoner, forstyrrelse af det lokale lipidmiljø eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerer også med calmodulin5 og moduleres af calcium ved både positiv og negativ feedback 6,7,8.
Hidtil har elektrofysiologiske undersøgelser af gatingmekanismen for Drosophila TRP og TRP-lignende (TRPL) kanaler været baseret på udskårne membranplastre, helcelleoptagelser fra dissocierede vildtype Drosophila fotoreceptorer og heteroudtrykte kanaler i S2-, SF9- eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men ikke på rensede kanaler. De strukturelle oplysninger om Drosophila TRP-kanalen i fuld længde forbliver også uklare. For at studere de elektrofysiologiske egenskaber af renset protein i et rekonstitueret membranmiljø og for at få strukturel information om Drosophila TRP-kanalen i fuld længde er opnåelse af rensede TRP-kanaler i fuld længde det nødvendige første skridt, svarende til de metoder, der anvendes i pattedyrs TRP-kanalundersøgelser 14,15,16,17.
For nylig blev der baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset18,19,20 først udviklet en affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense TRP-kanalen fra Drosophila-hovedhomogenater med streptavidinperler5. I betragtning af den lave kapacitet og dyre omkostninger ved streptavidinperler introduceres en forbedret rensningsprotokol her, der bruger His-mærket agnprotein og tilsvarende billige Ni-perler med meget højere kapacitet. Den foreslåede metode vil bidrage til at studere TRP-kanalens gatingmekanisme fra strukturelle vinkler og måle TRP-kanalens elektrofysiologiske egenskaber med rensede proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, som indeholder fem PDZ-domæner, er kernearrangøren af Drosophila fototransduktionsmaskiner. Tidligere undersøgelser viste, at INAD PDZ3 binder til TRP-kanalens C-terminale hale med udsøgt specificitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerer med NORPA 863-1095 fragment med en ekstremt høj bindingsaffinitet (KD = 30 nM). Disse resultater giver et solidt biokemisk grundlag for at designe affinitetsrensning plus konkurrencestrategi, som gør det muligt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) og Natural Science Foundation of Guangdong Province, Kina (nr. 2021A1515010796) til W. L. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for dets sproglige bistand under udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 신경과학. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
