טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית
Summary
בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .
Abstract
פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה היא אחד ממסלולי האיתות המצומדים לחלבון G המהירים ביותר הידועים. כדי להבטיח את הספציפיות והיעילות של מפל זה, תעלת הקטיון החדירה של הסידן (Ca2+), פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP), נקשרת בחוזקה לחלבון הפיגום, D (INAD) ללא הפסקה-ללא-אחרי-פוטנציאל, ויוצרת קומפלקס גדול של חלבון איתות עם חלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC) ופוטנציאל פוספוליפאז Cβ/No קולטן A (PLCβ/NORPA). עם זאת, התכונות הביוכימיות של ערוץ ה- TRP של דרוזופילה עדיין אינן ברורות. בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD, פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה שונה בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני. ראשית, שבר ההיסטידין המטוהר (שלו) מתויג NORPA 863-1095 נקשר לחרוזי Ni ושימש כפיתיון למשיכת קומפלקס חלבון INAD אנדוגני מראש דרוזופילה הומוגנטים. לאחר מכן, גלוטתיון S-transferase (GST) מטוהר יתר על המידה מתויג TRP 1261-1275 קטע נוסף ל- Ni-beads כדי להתחרות בערוץ TRP. לבסוף, תעלת ה-TRP בסופר-נטנט הופרדה מהפפטיד המוגזם TRP 1261-1275 על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנון הגטינג של תעלת ה-TRP Drosophila מזוויות ביוכימיות ומבניות כאחד. את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה מטוהרות ניתן למדוד גם בעתיד.
Introduction
פוטו-טרנסדוקציה היא תהליך שבו פוטונים נספגים מומרים לקודים חשמליים של נוירונים. הוא מעביר באופן בלעדי אופסינים ואת מפל האיתות המצומד לחלבון G הבא הן אצל בעלי חוליות והן אצל חסרי חוליות. ב-Drosophila, על-ידי שימוש בחמשת תחומי ה-PDZ שלה, פיגום חלבון ההשבתה-ללא-אחרי-פוטנציאל D (INAD) מארגן קומפלקס איתות סופראמולקולרי, המורכב מתעלת פוטנציאל קולטן חולף (TRP), פוספוליפאז Cβ/ללא פוטנציאל קולטן A (PLCβ/NORPA), וחלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC)1. היווצרותו של קומפלקס איתות סופראמולקולרי זה מבטיחה לוקליזציה תת-תאית נכונה, יעילות גבוהה וספציפיות של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. בקומפלקס זה, ערוצי TRP רגישים לאור פועלים כאפקטים במורד הזרם של NORPA ומתווכים את זרם הסידן ואת הדה-פולריזציה של פוטורצפטורים. מחקרים קודמים הראו כי פתיחת ערוץ ה-TRP של דרוזופילה מתווכת על ידי פרוטונים, שיבוש של סביבת השומנים המקומית או כוח מכני 2,3,4. ערוץ ה- TRP של Drosophila מקיים אינטראקציה גם עם calmodulin5 ומווסת על ידי סידן על ידי משוב חיובי ושליליכאחד 6,7,8.
עד כה, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים על מנגנון הגידור של תעלות Drosophila TRP ו-TRP דמויות TRP (TRPL) התבססו על טלאי ממברנה שנכרתה, הקלטות של תאים שלמים מפוטורצפטורים מסוג Drosophila מסוג פרא מנותקים, ותעלות הטרו-ביטוי בתאי S2, SF9 או HEK 2,9,10,11,12,13, אך לא בערוצים מטוהרים. גם המידע המבני של ערוץ ה-TRP Drosophila באורך מלא עדיין אינו ברור. על מנת לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של חלבון מטוהר בסביבת ממברנה משוחזרת ולקבל מידע מבני של תעלת ה- Drosophila TRP באורך מלא, קבלת תעלות TRP מטוהרות באורך מלא היא הצעד הראשון הנחוץ, בדומה למתודולוגיות המשמשות במחקרי תעלות TRP של יונקים 14,15,16,17.
לאחרונה, בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD 18,19,20, פותחה לראשונה אסטרטגיית טיהור זיקה בתוספת תחרות כדי לטהר את תעלת ה-TRP מהומוגנטים של ראש דרוזופילה על ידי חרוזי סטרפטווידין 5. בהתחשב בקיבולת הנמוכה ובהעלות היקרה של חרוזי סטרפטווידין, מוצג כאן פרוטוקול טיהור משופר המשתמש בחלבון הפיתיון המתויג שלו ובחרוזי Ni תואמים בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה. השיטה המוצעת תסייע לחקור את מנגנון ה-gating של תעלת ה-TRP מזוויות מבניות ולמדוד את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלת ה-TRP באמצעות חלבונים מטוהרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, המכיל חמישה תחומי PDZ, הוא מארגן הליבה של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי INAD PDZ3 נקשר לזנב מסוף C של ערוץ TRP עם ספציפיות מעודנת (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 טנדם מקיים אינטראקציה עם שבר NORPA 863-1095 עם זיקת קשירה גבוהה במיוחד (KD = 30 ננומטר). ממצאים אלה מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘31870746), מענקי מחקר בסיסיים של שנזן (JCYJ20200109140414636), והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ‘2021A1515010796) ל- W. L. אנו מודים ל-LetPub (www.letpub.com) על עזרתה הלשונית במהלך הכנת כתב יד זה.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 신경과학. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
