Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila
Summary
Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.
Abstract
A fototransdução de drosophila é uma das vias de sinalização mais rápidas conhecidas por proteína G. Para garantir a especificidade e eficiência dessa cascata, o canal de cáção de cálcio (Ca2+)permeável, o potencial de receptor transitório (TRP), liga-se firmemente à proteína do andaime, inativação-não-pós-potencial D (INAD), e forma um grande complexo proteico de sinalização com proteína específica dos olhos quinase C (ePKC) e phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLC/NORPA). No entanto, as propriedades bioquímicas do canal Drosophila TRP permanecem incertas. Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endorfário. Primeiro, o fragmento de histidina purificada (His)-tagged NORPA 863-1095 foi vinculado a ni-contas e usado como isca para puxar para baixo o complexo proteico inad endógeno de Dphila cabeça homogeneiza. Em seguida, o fragmento TRP 1261-1275 com a marca excessiva purificada foi adicionado às contas ni para competir com o canal TRP. Finalmente, o canal TRP no supernante foi separado do peptídeo TRP 1261-1275 excessivo por cromatografia de exclusão de tamanho. Este método permite estudar o mecanismo de gating do canal Drosophila TRP a partir de ângulos bioquímicos e estruturais. As propriedades de eletrofisiologia dos canais TRP de Drosophila purificados também podem ser medidas no futuro.
Introduction
Fototransdução é um processo onde fótons absorvidos são convertidos em códigos elétricos de neurônios. Ele retransmite exclusivamente opsinas e a seguinte cascata de sinalização acoplada à proteína G em ambos os vertebrados e invertebrados. Em Drosophila, usando seus cinco domínios PDZ, a inativação de proteína de andaime-não-pós-potencial D (INAD) organiza um complexo de sinalização supramolecular, que consiste em um canal de receptores transitórios (TRP), phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLCβ/NORPA) e proteína específica dos olhos quinase C (ePKC)1. A formação deste complexo de sinalização supramolecular garante a localização subcelular correta, alta eficiência e especificidade das máquinas de fototransdução de Drosophila. Neste complexo, canais TRP sensíveis à luz atuam como efeitos a jusante da NORPA e mediam o fluxo de cálcio e a despolarização dos fotorreceptores. Estudos anteriores mostraram que a abertura do canal Drosophila TRP é mediada por prótons, interrupção do ambiente lipídedo local ou força mecânica 2,3,4. O canal Drosophila TRP também interage com a calmodulina5 e é modulado pelo cálcio pelo feedback positivo e negativo 6,7,8.
Até agora, estudos de eletrofisiologia sobre o mecanismo de gating dos canais Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) foram baseados em patches de membrana excisada, gravações de células inteiras de fotorreceptores drosophila dissociados e canais hetero-expressos em células S2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mas não em canais purificados. As informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo também permanecem incertas. Para estudar as propriedades eletrofisiológicas da proteína purificada em um ambiente de membrana reconstituída e obter informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo, obter canais de TRP purificados é o primeiro passo necessário, semelhante às metodologias utilizadas nos estudos do canal TRP mamífera 14,15,16,17.
Recentemente, com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD 18,19,20, uma estratégia de purificação de afinidade mais competição foi desenvolvida pela primeira vez para purificar o canal TRP a partir de homogeneizados da cabeça de Drosophila por contas streptavidin 5. Considerando a baixa capacidade e o custo caro das contas streptavidin, um protocolo de purificação melhorado é introduzido aqui que usa proteína isca sua marcada e contas ni-beads de baixo custo correspondentes com capacidade muito maior. O método proposto ajudará a estudar o mecanismo de gating do canal TRP a partir de ângulos estruturais e a medir as propriedades eletrofisiológicas do canal TRP com proteínas purificadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, que contém cinco domínios PDZ, é o principal organizador das máquinas de fototransdução Drosophila. Estudos anteriores mostraram que o INAD PDZ3 se liga à cauda terminal C do canal TRP com especificidade requintada (KD = 0,3 μM)18. Inad PDZ45 tandem interage com o fragmento NORPA 863-1095 com uma afinidade de ligação extremamente alta (KD = 30 nM). Esses achados fornecem uma base bioquímica sólida para projetar a purificação de afinidade mais a es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ2020200109140414636) e Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (nº 2021A1515010796) a W. L. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por sua assistência linguística durante a elaboração deste manuscrito.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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