Den orale administration af dsRNA produceret af bakterier, en leveringsmetode til RNA-interferens (RNAi), der rutinemæssigt anvendes i Caenorhabditis elegans, blev med succes anvendt her på voksne myg. Vores metode giver mulighed for robuste reverse genetics-undersøgelser og transmissionsblokerende vektorstudier uden brug af injektion.
RNA-interferens har været et stærkt anvendt værktøj til omvendt genetisk analyse i to årtier. Hos voksne myg er dobbeltstrenget RNA (dsRNA) administration primært opnået via injektion, hvilket kræver betydelig tid og ikke er egnet til feltapplikationer. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer vi her en mere effektiv metode til robust aktivering af RNAi ved oral levering af dsRNA til voksne Anopheles gambiae. Lange dsRNA’er blev produceret i Escherichia coli stamme HT115 (DE3), og en koncentreret suspension af varmedræbte dsRNA-holdige bakterier i 10% saccharose blev tilbudt på bomuldskugler ad-libitum til voksne myg. Bomuldskugler blev udskiftet hver anden dag i løbet af behandlingen. Anvendelse af denne metode til at målrette mod doublesex (et gen involveret i kønsdifferentiering) eller gaffelhoved (som koder for en spytkirteltranskriptionsfaktor) resulterede i reduceret målgenekspression og/eller proteinimmunfluorescenssignal målt ved henholdsvis kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) eller fluorescenskonfokalmikroskopi. Defekter i spytkirtelmorfologi blev også observeret. Denne meget fleksible, brugervenlige, billige og tidseffektive metode til dsRNA-levering kan være bredt anvendelig på målgener, der er vigtige for insektvektorfysiologi og videre.
Mange sygdomme overføres af myg, hvilket gør undersøgelsen af mygfysiologi og genetik til en vigtig opgave. Anvendelsen af RNAi i disse organismer har været fremtrædende i de sidste 20 år og har muliggjort den funktionelle karakterisering af mange myggegener 1,2,3,4,5. Den mest almindeligt anvendte teknik til dsRNA-levering har været mikroinjektion, som har de ulemper, at det kan skade myggene og kræver betydelig tid og kræfter. Orale leveringsmetoder for RNAi er blevet testet, men hovedsageligt i larvestadiet af myggene 6,7,8,9. Oral levering af dsRNA i voksne myg er ikke blevet udforsket fuldt ud og kan være et nyttigt redskab til undersøgelse af vektorbiologi og vektorkontrol.
Malaria overføres af Anopheles myg, når en inficeret kvindelig myg tager et blodmåltid fra en uinficeret vært og injicerer spyt indeholdende malariaparasitter10. For i sidste ende at blive overført i spyt fra en myg skal parasitten overvinde mange forhindringer, herunder undvige myggens immunsystem, krydsning af midgutbarrieren og invasion af spytkirtlerne11. Myg spytkirtel (SG) arkitektur er nøglen til parasit invasion, og at arkitektur styres både af vigtige spytkirtel-udtrykt transkriptionsfaktorer samt determinanter for seksuel dimorfisme. Flere stærkt bevarede transkriptionsfaktorer er nødvendige for cellulær specifikation og homeostatisk vedligeholdelse af spytkirtlerne og for produktion og sekretion af spytproteiner, der fungerer i blodfodring 12,13,14. Gaffelhoved (Fkh) er en vinget helix transkriptionsfaktor, der fungerer som en vigtig regulator af insekt SG struktur og funktion (baseret på undersøgelser i frugtfluer og silkeorm møl)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SG’erne fungerer Fkh med Sage, en SG-specifik grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor, for at fremme SG-overlevelse og spytproduktion19. En vigtig, positiv co-regulator af spytproduktion i Drosophila er CrebA, en velunderstuderet leucinlynlåstranskriptionsfaktor, der opregulerer ekspressionen af sekretoriske vejgener 21,22,23. Der er også en stærk grad af morfologisk differentiering i kvindelige spytkirtler, der sandsynligvis spiller en nøglerolle, ikke kun i blodfodring, men også i parasitternes evne til at invadere dette væv24.
Mange af de gener, der er involveret i bestemmelsen af spytkirteloverlevelse, struktur, fysiologi og seksuel dimorfisme, har komplekse spatiotemporale ekspressionsprofiler 25,26,27, og de traditionelle leveringsmetoder for dsRNA til at inducere RNAi er ikke altid effektive til at målrette mod denne slags gener i dette eller andre væv. Imidlertid er oral levering af dsRNA i larvestadiet Aedes aegypti og An. gambiae myg blevet brugt med succes til at tavse den kvindespecifikke form af dsx-genet 9,28. Tidligere undersøgelser med dsRNA i myggespytkirtler viste, at selv om der var behov for store mængder dsRNA, var dæmpningseffekten relativt langvarig (mindst 13 dage)29. Her blev evnen hos den varmedræbte E. coli-stamme HT115 (DE3), der udtrykker sekvensspecifikt dsRNA for dsx, fkh eller CrebA, til at inducere RNAi-hæmning af disse gener hos voksne kvindelige myg testet. Oral administration af dsRNA-induceret gen knockdown i An. gambiae, med klare reduktioner i mRNA-niveauer og med fænotyper i overensstemmelse med tab af funktion af disse gener. Således vil denne tilgang sandsynligvis arbejde for at slå ned funktionen af en række spytkirtelgener.
Evnen til effektivt at levere dsRNA til An. gambiae myg ved oral fodring har brede konsekvenser for studier af vektorbiologi både i laboratoriet og i marken. Mikroinjektion har længe været accepteret som den foretrukne leveringsmåde for kemikalier, antistoffer, RNAi og genetiske modifikationsstrategier i myg43,44. Konsekvensen af betydelig fysisk manipulation, cellulær skade og stress kan undgås ved brug af oral levering, som også potentielt kan være egnet til store eller feltapplikationer. Tidligere arbejde har antydet, at RNAi virker allestedsnærværende inden for en individuel voksen myg29, hvilket giver mulighed for virkninger i alle væv, herunder spytkirtler. Ved at fodre myg med et stort antal dsRNA-ekspresserende E. coli, der fordøjes asynkront over en lang tidsramme, kan man potentielt opnå ensartet og ensartet eksponering for RNAi på tværs af alle individer i et bur. Denne metode gør det muligt at fodre et stort antal myg og analysere potentiel variabilitet af de resulterende fænotyper afhængigt af målgenet. En vigtig overvejelse er imidlertid muligheden for heterogen fordeling af bakterierne og dermed dsRNA i bomuldsfiberen. De 400 μL bakterier, der dagligt anvendes til myggesukkerfodring, ville indeholde ca. ≤4,6 μg dsRNA, som beskrevet og beregnet tidligere9, men mængden af dsRNA, der indtages af hver myg, blev ikke individuelt bestemt. Hvis opbygning af dsRNA-konstruktioner bliver rutine, giver denne enkle behandlingsprotokol mulighed for hurtig assimilering af denne teknik af enhver mygforsker. A priori er tidsforbruget under behandlingen (30 min om dagen) trivielt sammenlignet med den tid, det tager at lære og anvende mikroinjektion på lignende prøvestørrelser.
Feeding dsRNA anvendes rutinemæssigt til reverse genetics studier i modelorganismen Caenorhabditis elegans45. Dette tunge brugsniveau understreger værdien af den mundtlige leveringsmetode. Konstruktion af et An. gambiae genom-dækkende bibliotek i transformeret E. coli, svarende til det, der findes i C. elegans46,47, ville muliggøre hurtig omvendt genetisk screening i myg i øget skala. Det er dog vigtigt at bemærke, at metodens effektivitet i høj grad afhænger af de endogene niveauer af transkript, og om ekspressionen ikke er begrænset til målvævet, men udtrykt mere bredt 4,8,44. Derudover er der tegn på, at nogle insekticider kan fremkalde adfærdsmæssig undgåelse fra myg48, og fodring med bakterier, der potentielt fremkalder negative virkninger i dem, kan udløse lignende mønstre af undgåelse. I laboratoriets kontrollerede omgivelser, hvor myggene ikke havde en alternativ fødekilde, havde de ikke et valg om at undgå sukkervandet med E. coli, og behovet for en nærende kilde ville sandsynligvis tilsidesætte instinktet for at undgå bakterierne. Dette bør dog overvejes, hvis strategien var beregnet til at blive brugt i mindre kontrollerede omgivelser.
Det kan være muligt at målrette mod flere gener samtidigt (ved hjælp af en konstruktion, flere konstruktioner eller en blanding af transformerede bakterieisolater), men yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere effektiviteten. En anden vigtig overvejelse på dette punkt er evalueringen af mulige off-target eller synergistiske virkninger ved anvendelse af enkelte eller flere mål. Etablering af passende kontrolgener og -grupper er en vigtig del af forsøgsdesignet. Desuden er det fristende at spekulere i, at denne tilgang kan bruges til at målrette mod andre patogener eller vira49. Tidligere arbejde hen imod RNAi-induktion i myg blev udført under forhold, hvor reagenset blev injiceret direkte, så E. coli ikke var til stede. E. coli kan give et beskyttende rum, der muliggør langsommere frigivelse af dsRNA over tid, hvilket sikrer, at eksponeringen er mere eller mindre kontinuerlig over en meget længere periode29.
Endelig viser disse resultater, at virkningerne af denne teknik kan indstilles ved at justere tidsrammen (længde og startdag) for eksponeringen og den anvendte mængde E. coli . Denne funktion gjorde det muligt for os at studere funktionerne i essentielle gener (dsx og fkh) ved at identificere optimale knockdown-betingelser ved forsøg og fejl. Dette øger i høj grad sandsynligheden for, at målgener af interesse kan undersøges ved hjælp af denne teknik.
Sammenfattende blev det konstateret, at oral levering af RNAi til voksne myg kan være enkel, alsidig og en stærk tilgang til at studere myggenfunktion og til oprettelse af nye og formbare værktøjer til vektorkontrol af myggebårne sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke personalet og forskerne inden for Entomology Branch og Division of Parasitic Diseases and Malaria ved CDC og Brian Trigg og Michelle Chiu for hjælp til bakterieforberedelse på JHU og / eller nyttige diskussioner af dette arbejde. Vi takker JHMRI Insectary og manager Chris Kizito for adgang til og opdræt af An. gambiae myg. Vi takker Wei Huang (JHSPH) for hjælp til at opnå plasmider PJet GFP og pPB47 GFP til brug i denne undersøgelse. Finansiering til dette arbejde blev ydet af: NIH R21AI153588 (til DJA), et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoc Fellowship (til MW); og ved et tilskud fra Good Ventures Foundation og Open Philanthropy Project til CDC Foundation med titlen Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi sætter stor pris på hjælp fra JHU Microscope Facility personale og gældende NIH tilskud støtte til det anvendte mikroskop (NIH Grant #: S10OD016374). Resultaterne og konklusionerne i dette manuskript er forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis CDC’s synspunkter. Brug af handelsnavne er kun til identifikation og indebærer ikke godkendelse fra Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
BugDorm | BioQuip | 1452 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Damiens diet | BioServ | ||
DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
pGEMT easy | Promega | A3600 | |
Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
ANTIBODIES | |||
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
PRIMERS | |||
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |