Isolering og karakterisering af intakt Phycobilisome i cyanobakterier
Summary
Den nuværende protokol beskriver isoleringen af fykobiliomer fra cyanobakterier ved centrifugering gennem en diskontinuerlig saccharosetæthedsgradient. Fraktioner af intakte phycobilisomes bekræftes af 77K fluorescerende emissionsspektrum og SDS-PAGE analyse. De resulterende fykobilisome fraktioner er velegnede til negativ farvning af TEM og massespektrometri analyse.
Abstract
I cyanobakterier er phycobilisome et vitalt antenneproteinkompleks, der høster lys og overfører energi til fotosystem I og II til fotokemi. At studere strukturen og sammensætningen af fycobilisome er af stor interesse for forskere, fordi det afslører udviklingen og divergensen af fotosyntese i cyanobakterier. Denne protokol giver en detaljeret og optimeret metode til at bryde cyanobakterielle celler til lave omkostninger med en perle-tæppebanker effektivt. Den intakte phycobilisome kan derefter isoleres fra celleekstraktet ved saccharose gradient ultracentrifugering. Denne metode har vist, at den er egnet til både model og ikke-model cyanobakterier med forskellige celletyper. En trin-for-trin procedure er også fastsat for at bekræfte integriteten og egenskaben af phycobiliproteiner ved 77K fluorescens spektroskopi og SDS-PAGE plettet af zink sulfat og Coomassie Blue. Det isolerede fycobilisome kan også underkastes yderligere strukturelle og kompositoriske analyser. Samlet set giver denne protokol en nyttig startvejledning, der giver forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier, mulighed for hurtigt at isolere og karakterisere intakt fycobilisome.
Introduction
Phycobilisome (PBS) er et enormt vandopløseligt pigmentproteinkompleks, der fastgøres til den cytoplasmatiske side af fotosystemerne i thylakoidmembranerne i cyanobakterier1. PBS består primært af farvede phycobiliproteiner og farveløse linkerproteiner1,2. De phycobiliproteiner kan opdeles i fire store grupper: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, og allophycocyanin3. De fire store grupper absorberer forskellige bølgelængder af lysenergi i intervallet 490-650 nm, som klorofyl absorberes ineffektivt3. PBS kan fungere som en lyshøstantenne til opsamling af lysenergi og levering til Photosystem II og I4.
Strukturen og sammensætningen af PBS varierer fra art til art. Samlet set er tre former for phycobilisome (hemidiscodial, bundtformet og stangformet) blevet identificeret i forskellige cyanobakterielle arter5. Selv i de samme arter ændres sammensætningen af PBS som reaktion på miljøet, såsom lyskvalitet og næringsstofudtømning6,7,8,9,10,11. Derfor har forsøgsproceduren for at isolere PBS fra cyanobakterier været medvirkende til at studere PBS12. I løbet af flere årtier har mange forskellige protokoller isoleret PBS og analyseret dets struktur, sammensætning og funktion6,7,8,12,13,14,15,16,17. De mange forskellige metoder til PBS-isolering giver faktisk fleksibilitet til at isolere komplekset hos forskellige arter med forskellige reagenser og instrumenter. Det gør dog også det vanskeligere at vælge en passende protokol for forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier og PBS. Derfor er en generaliseret og ligetil protokol udviklet i dette arbejde for dem, der er interesseret i at starte PBS isolation fra cyanobakterier.
Metoderne til isolering af PBS fra tidligere publikationer er sammenfattet her. Da PBS er et vandopløseligt proteinkompleks og let adskilles, kræves der en høj ionisk styrkephosphatbuffer for at stabilisere PBS under ekstraktion18. Flere forskningsartikler, der beskriver metoder til isolering af PBS fra cyanobakterium, er tidligere blevet offentliggjort. De fleste af metoderne kræver en høj koncentration af fosfatbuffer8,14,15,18,19. Men procedurerne for mekanisk forstyrrelse af cellerne varierer, såsom glasperler-assisteret ekstraktion, sonikering20, og fransk presse6,8,14. Forskellige phycobiliproteiner kan fås ved nedbør med ammoniumsulfat20 og renses af HPLC21 eller en kromatografisk kolonne22. På den anden side kan intakt PBS let isoleres ved saccharosetæthedsgradient ultracentrifugering6,8,15.
I denne protokol blev et model cyanobacterium og et ikke-model cyanobacterium brugt som materialer til PBS-isolering. De er model encellede glukose-tolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (herefter Syn6803) og ikke-model filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (herefter JSC-1), henholdsvis7,23,24. Protokollen begynder med afbrydelse af den encellede og filamentøse cyanobakterier i en høj-ionisk styrke fosfat buffer. Efter lysis opsamles supernatanterne ved centrifugering og behandles derefter med et ikkeionisk vaskemiddel (Triton X-100) for at opløse de vandopløselige proteiner fra thylakoidmembranerne. De samlede vandopløselige proteiner påføres en diskontinurosetæthedsgradient for at fraktionere PBS. Den diskontinuerlige saccharosegradient i denne protokol består af fire saccharoseopløsninger og opdeler den intakte PBS i de laveste fraktioner saccharoselag25. PBS’ integritet kan analyseres af SDS-PAGE, zinkfarvning og 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denne metode er velegnet til forskere, der har til formål at isolere intakt PBS fra cyanobakterier og studere dens spektrale, strukturelle og kompositoriske egenskaber.
Der er flere fordele ved denne protokol. (1) Denne metode er standardiseret og kan anvendes til isolering af intakt PBS fra både encellet og filamentøs cyanobakterier. De fleste af artiklerne beskriver den metode, der anvendes i enten én type cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denne metode udføres ved stuetemperatur, da PBS tager afstand ved lav temperatur19,27. (3) Denne metode beskriver brugen af en perle-tæppebanker til at forstyrre cellerne; derfor er det billigere og sikrere end højtrykt fransk presse og mulig høreskade fra soniker i andre metoder8,13,14,20. (4) Denne metode isolerer intakt PBS ved saccharosegradient ultracentrifugering. På denne måde kan intakt PBS med forskellige størrelser og delvist dissocierede PBS adskilles baseret på saccharosekoncentration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel og standardmetode til isolering af intakt PBS i to typer cyanobakterier, encellet model Syn6803 og filamentøs ikke-model JSC-1. De kritiske trin i protokollen er celle homogenisering og ultracentrifugering på en diskontinuerlig tæthed gradient af saccharose. Generelt er afbrydelsen af filamentøse celler mere kompliceret end encellede celler. Forøgelse af mængden af udgangsmaterialet (den våde vægt af cellepillen) og gentagelsen af perle-slå var nyttigt at øge udbyttet af PBS fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University for bekvem brug af ultracentrifugen. De cyanobakterielle stammer Synechocystis sp. PCC 6803 og Leptolyngbya sp. JSC-1 blev begavet fra Dr. Chu, Hsiu-An på den akademiske verden Sinica, Taiwan, og Dr. Donald A. Bryant på Pennsylvania State University, USA, henholdsvis. Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Teknologi (Taiwan) (109-2636-B-002-013- og 110-2628-B-002-065-) og Undervisningsministeriet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 og 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. 생화학. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
