Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries
Summary
Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.
Abstract
Chez les cyanobactéries, le phycobilisome est un complexe protéique d’antenne vital qui récolte la lumière et transfère de l’énergie aux photosystèmes I et II pour la photochimie. L’étude de la structure et de la composition du phycobilisome est d’un grand intérêt pour les scientifiques car elle révèle l’évolution et la divergence de la photosynthèse chez les cyanobactéries. Ce protocole fournit une méthode détaillée et optimisée pour casser efficacement les cellules cyanobactériennes par un batteur de perles. Le phycobilisome intact peut ensuite être isolé de l’extrait cellulaire par ultracentrifugation par gradient de saccharose. Cette méthode s’est avérée adaptée aux cyanobactéries modèles et non modèles avec différents types de cellules. Une procédure étape par étape est également fournie pour confirmer l’intégrité et la propriété des phycobiliprotéines par spectroscopie de fluorescence 77K et SDS-PAGE coloré par sulfate de zinc et bleu de Coomassie. Le phycobilisome isolé peut également être soumis à d’autres analyses structurelles et compositionnelles. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un guide de départ utile qui permet aux chercheurs qui ne connaissent pas les cyanobactéries d’isoler et de caractériser rapidement les phycobilisomes intacts.
Introduction
Le phycobilisome (PBS) est un énorme complexe pigment-protéine soluble dans l’eau qui se fixe au côté cytoplasmique des photosystèmes dans les membranes thylakoïdes des cyanobactéries1. Le PBS est principalement composé de phycobiliprotéines colorées et de protéines linker incolores1,2. Les phycobiliprotéines peuvent être divisées en quatre grands groupes : la phycoérythrine, la phycoérythricyanine, la phycocyanine et l’allophycocyanine3. Les quatre grands groupes absorbent différentes longueurs d’onde d’énergie lumineuse dans la gamme de 490 à 650 nm, que les chlorophylles absorbent de manière inefficace3. Le PBS peut servir d’antenne de collecte de lumière pour collecter l’énergie lumineuse et la fournir aux photosystèmes II et I4.
La structure et la composition du PBS varient d’une espèce à l’autre. Collectivement, trois formes de phycobilisomes (hémidiscodiales, en forme de faisceau et en forme de bâtonnet) ont été identifiées chez différentes espèces de cyanobactéries5. Même chez la même espèce, la composition du PBS change en fonction de l’environnement, comme la qualité de la lumière et l’épuisement des nutriments6,7,8,9,10,11. Par conséquent, la procédure expérimentale visant à isoler le PBS des cyanobactéries a joué un rôle déterminant dans l’étude du PBS12. Pendant plusieurs décennies, de nombreux protocoles différents ont isolé le PBS et analysé sa structure, sa composition et sa fonction6,7,8,12,13,14,15,16,17. La grande variété de méthodes d’isolement pbs offre en effet une flexibilité dans l’isolation du complexe chez différentes espèces avec différents réactifs et instruments. Cependant, cela rend également le choix d’un protocole approprié plus difficile pour les scientifiques peu familiers avec les cyanobactéries et le PBS. Par conséquent, un protocole généralisé et simple est développé dans ce travail pour ceux qui s’intéressent à commencer l’isolement PBS des cyanobactéries.
Les méthodes d’isolement du PBS des publications précédentes sont résumées ici. Étant donné que le PBS est un complexe protéique soluble dans l’eau et qu’il est facilement dissocié, un tampon phosphate à haute résistance ionique est nécessaire pour stabiliser le PBS pendant l’extraction18. Plusieurs articles de recherche décrivant des méthodes d’isolement du PBS à partir de cyanobactéries ont été publiés dans le passé. La plupart des méthodes nécessitent une forte concentration de tampon phosphate8,14,15,18,19. Cependant, les procédures de perturbation mécanique des cellules varient, telles que l’extraction assistée par billes de verre, la sonication20 et la presse Français 6,8,14. Différentes phycobiliprotéines peuvent être obtenues par précipitation avec du sulfate d’ammonium20 et purifiées par CLHP21 ou une colonne chromatographique22. D’autre part, le PBS intact peut être facilement isolé par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose6,8,15.
Dans ce protocole, une cyanobactérie modèle et une cyanobactérie non modèle ont été utilisées comme matériaux pour l’isolation PBS. Il s’agit de Synechocystis sp. PCC 6803 (ci-après Syn6803) et de Leptolyngbya sp. JSC-1 filamenteux non modèle, tolérant au glucose, et de Leptolyngbya sp. JSC-1 (ci-après JSC-1), respectivement7,23,24. Le protocole commence par la perturbation des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses dans un tampon phosphate à haute résistance ionique. Après lyse, les surnageants sont collectés par centrifugation puis traités avec un détergent non ionique (Triton X-100) pour solubiliser les protéines hydrosolubles des membranes thylakoïdes. Les protéines totales solubles dans l’eau sont appliquées sur un gradient de densité de saccharose discontinu pour fractionner le PBS. Le gradient de saccharose discontinu dans ce protocole se compose de quatre solutions de saccharose et divise le PBS intact dans les fractions les plus faibles de la couche de saccharose25. L’intégrité du PBS peut être analysée par SDS-PAGE, coloration au zinc et spectroscopie de fluorescence 77K6,7,8,26. Cette méthode convient aux scientifiques qui visent à isoler le PBS intact des cyanobactéries et à étudier ses propriétés spectrales, structurelles et compositionnelles.
Il y a plusieurs avantages de ce protocole. (1) Cette méthode est normalisée et peut être utilisée pour isoler le PBS intact des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses. La plupart des articles décrivent la méthode qui s’appliquait à l’un ou l’autre type de cyanobactéries4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Cette méthode est réalisée à température ambiante, car le PBS se dissocie à basse température19,27. (3) Cette méthode décrit l’utilisation d’un batteur de perles pour perturber les cellules; par conséquent, il est moins cher et plus sûr que la presse à Français à haute pression et les dommages auditifs possibles du sonicator dans d’autres méthodes8,13,14,20. (4) Cette méthode isole le PBS intact par ultracentrifugation par gradient de saccharose. De cette façon, le PBS intact avec différentes tailles et le PBS partiellement dissocié peuvent être séparés en fonction de la concentration en saccharose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode simple et standard pour isoler le PBS intact dans deux types de cyanobactéries, le modèle unicellulaire Syn6803 et le non-modèle filamenteux JSC-1. Les étapes critiques du protocole sont l’homogénéisation cellulaire et l’ultracentrifugation sur un gradient de densité discontinu de saccharose. Généralement, la perturbation des cellules filamenteuses est plus compliquée que les cellules unicellulaires. L’augmentation de la quantité de matière première (le poids humide de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University pour l’utilisation pratique de l’ultracentrifugeuse. Les souches cyanobactériennes Synechocystis sp. PCC 6803 et Leptolyngbya sp. JSC-1 ont été offertes par le Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taiwan, et le Dr Donald A. Bryant à la Pennsylvania State University, USA, respectivement. Ce travail a été financé par le ministère de la Science et de la Technologie (Taïwan) (109-2636-B-002-013- et 110-2628-B-002-065-) et le ministère de l’Éducation (Taïwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 et 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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