सायनोबैक्टीरिया में बरकरार Phycobilisome के अलगाव और लक्षण वर्णन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक असंतत सुक्रोज घनत्व ढाल के माध्यम से centrifugation द्वारा साइनोबैक्टीरिया से phycobilisomes के अलगाव का विवरण देता है। बरकरार phycobilisomes के अंश 77K फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और SDS-पेज विश्लेषण द्वारा पुष्टि कर रहे हैं। परिणामस्वरूप phycobilisome अंश TEM और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के नकारात्मक धुंधला के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
साइनोबैक्टीरिया में, phycobilisome एक महत्वपूर्ण एंटीना प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो प्रकाश की कटाई करता है और फोटोकेमिस्ट्री के लिए फोटोसिस्टम I और II में ऊर्जा स्थानांतरित करता है। phycobilisome की संरचना और संरचना का अध्ययन वैज्ञानिकों के लिए बहुत रुचि का है क्योंकि यह साइनोबैक्टीरिया में प्रकाश संश्लेषण के विकास और विचलन को प्रकट करता है। यह प्रोटोकॉल एक मनका-बीटर द्वारा कम लागत पर साइनोबैक्टीरिया कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक तोड़ने के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित विधि प्रदान करता है। बरकरार phycobilisome तो सुक्रोज ढाल ultracentrifugation द्वारा सेल निकालने से अलग किया जा सकता है. इस विधि ने विभिन्न सेल प्रकारों के साथ मॉडल और गैर-मॉडल साइनोबैक्टीरिया दोनों के लिए उपयुक्त होने का प्रदर्शन किया है। जस्ता सल्फेट और कूमासी ब्लू द्वारा दागे गए 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसडीएस-पेज द्वारा फाइकोबिलिप्रोटीन की अखंडता और संपत्ति की पुष्टि करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया भी प्रदान की जाती है। अलग-थलग phycobilisome भी आगे संरचनात्मक और compositional विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक सहायक शुरुआती मार्गदर्शिका प्रदान करता है जो साइनोबैक्टीरिया से अपरिचित शोधकर्ताओं को जल्दी से अलग करने और बरकरार phycobilisome को चिह्नित करने की अनुमति देता है।
Introduction
Phycobilisome (PBS) एक विशाल पानी में घुलनशील वर्णक-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो साइनोबैक्टीरिया 1 के थाइलाकोइड झिल्ली में फोटोसिस्टम के साइटोप्लाज्मिक पक्ष से जुड़ा हुआ है। पीबीएस मुख्य रूप से रंगीन phycobiliproteins और रंगहीन linker प्रोटीन 1,2 से बना है। phycobiliproteins को चार प्रमुख समूहों में विभाजित किया जा सकता है: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, और allophycocyanin3। चार प्रमुख समूह 490-650 एनएम की सीमा में प्रकाश ऊर्जा के विभिन्न तरंग दैर्ध्य को अवशोषित करते हैं, जो क्लोरोफिल ने अकुशलता से अवशोषित किया। पीबीएस प्रकाश ऊर्जा एकत्र करने और इसे फोटोसिस्टम II और I4 तक पहुंचाने के लिए एक प्रकाश-कटाई एंटीना के रूप में कार्य कर सकता है।
पीबीएस की संरचना और संरचना प्रजातियों से प्रजातियों में भिन्न होती है। सामूहिक रूप से, phycobilisome के तीन आकार (hemidiscodial, बंडल के आकार का, और रॉड के आकार का) विभिन्न साइनोबैक्टीरिया प्रजातियों में पहचाना गया है5। यहां तक कि एक ही प्रजाति में, पीबीएस की संरचना पर्यावरण के जवाब में बदलती है, जैसे कि प्रकाश की गुणवत्ता और पोषक तत्वों की कमी 6,7,8,9,10,11। इसलिए, साइनोबैक्टीरिया से पीबीएस को अलग करने की प्रयोगात्मक प्रक्रिया पीबीएस 12 का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई है। कई दशकों में, कई अलग-अलग प्रोटोकॉल ने पीबीएस को अलग-थलग कर दिया है और इसकी संरचना, संरचना और कार्य 6,7,8,12,13,14,15,16,17 का विश्लेषण किया है। पीबीएस अलगाव के लिए तरीकों की विस्तृत विविधता वास्तव में विभिन्न अभिकर्मकों और उपकरणों के साथ विभिन्न प्रजातियों में परिसर को अलग करने में लचीलापन प्रदान करती है। हालांकि, यह साइनोबैक्टीरिया और पीबीएस से अपरिचित वैज्ञानिकों के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल चुनने को और अधिक कठिन बनाता है। इसलिए, साइनोबैक्टीरिया से पीबीएस अलगाव शुरू करने में रुचि रखने वालों के लिए इस काम में एक सामान्यीकृत और सीधा प्रोटोकॉल विकसित किया गया है।
पिछले प्रकाशनों से पीबीएस को अलग करने के तरीकों को यहां संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। चूंकि पीबीएस एक पानी में घुलनशील प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है और आसानी से अलग हो जाता है, इसलिए निष्कर्षण 18 के दौरान पीबीएस को स्थिर करने के लिए एक उच्च आयनिक ताकत फॉस्फेट बफर की आवश्यकता होती है। कई शोध लेख जो साइनोबैक्टीरियम से पीबीएस के अलगाव के तरीकों का वर्णन करते हैं, अतीत में प्रकाशित किए गए हैं। अधिकांश विधियों को फॉस्फेट बफर 8,14,15,18,19 की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। हालांकि, कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के लिए प्रक्रियाएं अलग-अलग होती हैं, जैसे कि ग्लास मोतियों-सहायता प्राप्त निष्कर्षण, sonication20, और फ्रेंच प्रेस 6,8,14। अमोनियम सल्फेट 20 के साथ वर्षा द्वारा विभिन्न phycobiliproteins प्राप्त किया जा सकता है और HPLC21 या एक क्रोमैटोग्राफिक कॉलम 22 द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। दूसरी ओर, बरकरार पीबीएस को आसानी से सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन 6,8,15 द्वारा अलग किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक मॉडल साइनोबैक्टीरियम और एक गैर-मॉडल साइनोबैक्टीरियम का उपयोग पीबीएस अलगाव के लिए सामग्री के रूप में किया गया था। वे मॉडल एककोशिकीय ग्लूकोज-सहिष्णु Synechocystis sp. PCC 6803 (इसके बाद Syn6803) और गैर मॉडल फिलामेंटस Leptolyngbya sp. JSC-1 (इसके बाद JSC-1) क्रमशः 7,23,24 हैं। प्रोटोकॉल एक उच्च आयनिक-शक्ति फॉस्फेट बफर में एककोशिकीय और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया के विघटन से शुरू होता है। lysis के बाद, supernatants centrifugation द्वारा एकत्र किए जाते हैं और फिर थाइलाकोइड झिल्ली से पानी में घुलनशील प्रोटीन को घुलनशील बनाने के लिए एक गैर-आयनिक डिटर्जेंट (ट्राइटन एक्स -100) के साथ इलाज किया जाता है। कुल पानी में घुलनशील प्रोटीन को पीबीएस को विभाजित करने के लिए एक असंतत सुक्रोज घनत्व ढाल पर लागू किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में असंतत सुक्रोज ढाल में चार सुक्रोज समाधान होते हैं और सुक्रोज परत 25 के सबसे कम अंशों में बरकरार पीबीएस को विभाजित करते हैं। पीबीएस की अखंडता का विश्लेषण एसडीएस-पेज, जस्ता-धुंधला, और 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी 6,7,8,26 द्वारा किया जा सकता है। यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयुक्त है जो साइनोबैक्टीरिया से बरकरार पीबीएस को अलग करने और इसके वर्णक्रमीय, संरचनात्मक और रचनात्मक गुणों का अध्ययन करने का लक्ष्य रखते हैं।
इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। (1) इस विधि को मानकीकृत किया गया है और इसका उपयोग एककोशिकीय और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया दोनों से बरकरार पीबीएस को अलग करने के लिए किया जा सकता है। अधिकांश लेख उस विधि का वर्णन करते हैं जो या तो एक प्रकार के साइनोबैक्टीरिया 4,7,8,12,13,14,16,18 में लागू होती है। (2) यह विधि कमरे के तापमान पर की जाती है, क्योंकि पीबीएस कम तापमान 19,27 पर अलग हो जाता है। (3) यह विधि कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक मनका-बीटर का उपयोग करने का वर्णन करती है; इसलिए, यह उच्च दबाव वाले फ्रांसीसी प्रेस और अन्य तरीकों में सोनिकेटर से संभावित सुनवाई क्षति की तुलना में सस्ता और सुरक्षित है8,13,14,20। (4) यह विधि सुक्रोज ग्रेडिएंट अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बरकरार पीबीएस को अलग करती है। इस तरह, विभिन्न आकारों और आंशिक रूप से अलग किए गए पीबीएस के साथ बरकरार पीबीएस को सुक्रोज एकाग्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल दो प्रकार के साइनोबैक्टीरिया, एककोशिकीय मॉडल Syn6803, और फिलामेंटस गैर-मॉडल JSC-1 में बरकरार पीबीएस को अलग करने के लिए एक सरल और मानक विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणसुक्रोज के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों प्रौद्योगिकी कॉमन्स, जीवन विज्ञान के कॉलेज, राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय ultracentrifuge के सुविधाजनक उपयोग के लिए धन्यवाद. साइनोबैक्टीरिया उपभेदों Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 और Leptolyngbya एसपी जेएससी -1 को क्रमशः अकादमिक सिनिका, ताइवान में डॉ चू, Hsiu-An और पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका में डॉ डोनाल्ड ए ब्रायंट से उपहार में दिया गया था। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (ताइवान) (109-2636-B-002-013- और 110-2628-B-002-065-) और शिक्षा मंत्रालय (ताइवान) द्वारा वित्त पोषित किया गया था युशान यंग स्कॉलर प्रोग्राम (109V1102 और 110V1102)।
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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