Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri
Summary
L’attuale protocollo descrive in dettaglio l’isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall’analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l’analisi della spettrometria di massa.
Abstract
Nei cianobatteri, il ficobilisoma è un complesso proteico antenna vitale che raccoglie la luce e trasferisce energia al fotosistema I e II per la fotochimica. Studiare la struttura e la composizione del ficobilisoma è di grande interesse per gli scienziati perché rivela l’evoluzione e la divergenza della fotosintesi nei cianobatteri. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato e ottimizzato per rompere le cellule cianobatteriche a basso costo da un battitore di perline in modo efficiente. Il ficobilisoma intatto può quindi essere isolato dall’estratto cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo metodo ha dimostrato di essere adatto sia per cianobatteri modello che non modello con diversi tipi di cellule. Viene inoltre fornita una procedura passo-passo per confermare l’integrità e la proprietà delle ficobiliproteine mediante spettroscopia di fluorescenza 77K e SDS-PAGE colorato da solfato di zinco e Coomassie Blue. Il ficobilisoma isolato può anche essere sottoposto ad ulteriori analisi strutturali e compositive. Nel complesso, questo protocollo fornisce un’utile guida di partenza che consente ai ricercatori che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare e caratterizzare rapidamente il ficobilisoma intatto.
Introduction
Il ficobilisoma (PBS) è un enorme complesso pigmento-proteina solubile in acqua che si attacca al lato citoplasmatico dei fotosistemi nelle membrane tilacoidi dei cianobatteri1. La PBS è composta principalmente da ficobiliproteine colorate e proteine linker incolori1,2. Le ficobiliproteine possono essere suddivise in quattro gruppi principali: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina e alloficocianina3. I quattro gruppi principali assorbono diverse lunghezze d’onda dell’energia luminosa nell’intervallo 490-650 nm, che le clorofille hanno assorbito in modo inefficiente3. Il PBS può fungere da antenna per la raccolta della luce per la raccolta dell’energia luminosa e la consegna al fotosistema II e I4.
La struttura e la composizione del PBS variano da specie a specie. Collettivamente, tre forme di ficobilisoma (emidiscodiale, a forma di fascio e a forma di bastoncello) sono state identificate in diverse specie cianobatteriche5. Anche nella stessa specie, la composizione del PBS cambia in risposta all’ambiente, come la qualità della luce e l’esaurimento dei nutrienti6,7,8,9,10,11. Pertanto, la procedura sperimentale per isolare PBS dai cianobatteri è stata determinante nello studio di PBS12. Nel corso di diversi decenni, molti protocolli diversi hanno isolato PBS e analizzato la sua struttura, composizione e funzione6,7,8,12,13,14,15,16,17. L’ampia varietà di metodi per l’isolamento PBS fornisce infatti flessibilità nell’isolare il complesso in diverse specie con diversi reagenti e strumenti. Tuttavia, rende anche più difficile la scelta di un protocollo adatto per gli scienziati che non hanno familiarità con cianobatteri e PBS. Pertanto, in questo lavoro viene sviluppato un protocollo generalizzato e diretto per coloro che sono interessati ad avviare l’isolamento PBS dai cianobatteri.
I metodi per isolare PBS dalle pubblicazioni precedenti sono riassunti qui. Poiché PBS è un complesso proteico solubile in acqua ed è facilmente dissociato, è necessario un tampone fosfato ad alta forza ionica per stabilizzare PBS durante l’estrazione18. Diversi articoli di ricerca che descrivono i metodi per l’isolamento della PBS dal cianobatterio sono stati pubblicati in passato. La maggior parte dei metodi richiede un’alta concentrazione di tampone fosfato8,14,15,18,19. Tuttavia, le procedure per l’interruzione meccanica delle cellule variano, come l’estrazione assistita da perle di vetro, la sonicazione20 e la stampa francese6,8,14. Diverse ficobiliproteine possono essere ottenute per precipitazione con solfato di ammonio20 e purificate da HPLC21 o da una colonna cromatografica22. D’altra parte, il PBS intatto può essere facilmente isolato dall’ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio6,8,15.
In questo protocollo, un cianobatterio modello e un cianobatterio non modello sono stati utilizzati come materiali per l’isolamento PBS. Sono modello unicellulare tollerante al glucosio Synechocystis sp. PCC 6803 (di seguito Syn6803) e Leptolyngbya sp. filamentosa non modello JSC-1 (di seguito JSC-1), rispettivamente7,23,24. Il protocollo inizia con l’interruzione dei cianobatteri unicellulari e filamentosi in un tampone fosfato ad alta resistenza ionica. Dopo la lisi, i supernatanti vengono raccolti per centrifugazione e quindi trattati con un detergente non ionico (Triton X-100) per solubilizzare le proteine idrosolubili dalle membrane tilacoidi. Le proteine idrosolubili totali vengono applicate a un gradiente di densità discontinuo di saccarosio per frazionare il PBS. Il gradiente discontinuo di saccarosio in questo protocollo è costituito da quattro soluzioni di saccarosio e suddivide il PBS intatto nelle frazioni più basse dello strato di saccarosio25. L’integrità del PBS può essere analizzata mediante SDS-PAGE, colorazione dello zinco e spettroscopia di fluorescenza 77K6,7,8,26. Questo metodo è adatto per gli scienziati che mirano a isolare PBS intatto dai cianobatteri e studiare le sue proprietà spettrali, strutturali e compositive.
Ci sono diversi vantaggi di questo protocollo. (1) Questo metodo è standardizzato e può essere utilizzato per isolare PBS intatto da cianobatteri sia unicellulari che filamentosi. La maggior parte degli articoli descrive il metodo che si applicava in entrambi i tipi di cianobatteri4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Questo metodo viene eseguito a temperatura ambiente, poiché PBS si dissocia a bassa temperatura19,27. (3) Questo metodo descrive l’uso di un battitore di perline per interrompere le cellule; pertanto, è più economico e più sicuro della stampa francese ad alta pressione e possibili danni all’udito da sonicatore in altri metodi8,13,14,20. (4) Questo metodo isola il PBS intatto mediante ultracentrizzazione a gradiente di saccarosio. In questo modo, PBS intatto con dimensioni diverse e PBS parzialmente dissociato può essere separato in base alla concentrazione di saccarosio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice e standard per isolare PBS intatto in due tipi di cianobatteri, il modello unicellulare Syn6803 e il filamentoso non modello JSC-1. Le fasi critiche del protocollo sono l’omogeneizzazione cellulare e l’ultracentrifugazione su un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Generalmente, la distruzione delle cellule filamentose è più complicata di quelle unicellulari. L’aumento della quantità di materiale di partenza (il peso umido del pellet cellulare) e la ripetizione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University per il comodo uso dell’ultracentrifuga. I ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 sono stati donati rispettivamente dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan, e dal Dr. Donald A. Bryant presso la Pennsylvania State University, USA. Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e dal Ministero dell’Istruzione (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 e 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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