シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け
Summary
現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。
Abstract
シアノバクテリアでは、フィコビリソームは光を収穫し、光化学のために光システムIとIIにエネルギーを伝達する重要なアンテナタンパク質複合体です。系統の構造と組成を研究することは、シアノバクテリアにおける光合成の進化と発散を明らかにするため、科学者にとって大きな関心事です。このプロトコルは、ビードビーターによって効率的にシアノバクテリア細胞を低コストで破壊する詳細かつ最適化された方法を提供します。その後、無傷のフィコビリソームを、ショ糖勾配超遠心分離によって細胞抽出物から分離することができる。この方法は、異なる細胞タイプのモデルおよび非モデルシアノバクテリアの両方に適している実証されている。77K蛍光分光法と硫酸亜鉛とクマシーブルー染色SDS-PAGEによるフィコビリタンパク質の完全性と性質を確認するためのステップバイステップの手順も提供されています。分離されたフィコビリソームは、さらなる構造解析および組成解析を行うこともできます。全体として、このプロトコルは、シアノバクテリアに精通していない研究者が無傷のフィコビリソームを迅速に単離し、特徴付けることを可能にする有用な開始ガイドを提供する。
Introduction
フィコビリソーム(PBS)は、シアノバクテリア1のチラコイド膜中の光系の細胞質側に付着する巨大な水溶性色素タンパク質複合体です。PBSは主に、着色されたフィコビリタンパク質と無色リンカータンパク質1,2で構成されています。フィコビリタンパク質は、フィコエリスリン、フィコエリコシアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン3の4つの主要なグループに分けることができます。4つの主要なグループは、クロロフィルが非効率的に吸収した490〜650nmの範囲で光エネルギーの異なる波長を吸収する3。PBSは光エネルギーを集め、それを光システムIIおよびI4に渡すライトハーベニングアンテナとして役立つことができる。
PBSの構造と組成は種によって異なります。総称して、異なるシアノバクテリア種5において、フィコビリソーム(ヘミディスコジアル、束状、および棒状)の3つの形状が同定されている。同種においても、PBSの組成は、光質や栄養枯渇などの環境に応じて変化する6,7,8,9,10,11。そこで、シアノバクテリアからPBSを単離する実験手順は、PBS12の研究に役立っています。数十年にわたり、多くの異なるプロトコルがPBSを分離し、その構造、組成、および機能6,7,8,12,13,14,15,16,17を分析してきました。PBSの分離のための多種多様な方法は確かに異なる試薬および器械と異なった種の複合体を単離する柔軟性を提供する。しかし、それはまた、シアノバクテリアやPBSに慣れていない科学者にとって、適切なプロトコルを選択することがより困難になります。したがって、チアノバクテリアからのPBS分離を開始することに興味がある人のために、この研究では一般化された簡単なプロトコルが開発されています。
前の出版物からPBSを分離する方法をここに要約します。PBSは水溶性タンパク質複合体であり容易に解約されるため、抽出時にPBSを安定化させるために高いイオン強度リン酸緩衝液が必要となる。チアノバクテリウムからのPBSの分離方法を記述したいくつかの研究記事が過去に公開されています。.ほとんどの方法は、高濃度のリン酸緩衝液8,14,15,18,19を必要とする。しかし、細胞の機械的破壊のための手順は、例えば、ガラスビーズ支援抽出、超音波20、およびフランスの圧知6、8,14など、様々です。異なるフィコビリタンパク質は、硫酸アンモニウム20で沈殿し、HPLC21またはクロマトグラフィーカラム22で精製することによって得ることができる。一方、無傷のPBSは、スクロース密度勾配超遠心分離6,8,15によって容易に単離することができる。
このプロトコルでは、1つのモデルシアノバクテリウムと1つの非モデルシアノバクテリウムがPBS分離の材料として使用されました。これらは、モデル単細胞グルコース耐性シネクロシスティスsp.PCC 6803(以下Syn6803)および非モデル糸状レプトレングビヤsp.JSC-1(以下JSC-1)、それぞれ7,23,24である。このプロトコルは、高イオン強度リン酸緩衝液中の単細胞および糸状シアノバクテリアの破壊によって始まります。溶解後、上清を遠心分離によって回収し、非イオン性洗剤(Triton X-100)で処理し、チラコイド膜から水溶性タンパク質を可溶化する。全水溶性タンパク質は、不連続なスクロース密度勾配に適用され、PBSを分画する。このプロトコルの不連続なスクロース勾配は、4つのスクロース溶液で構成され、スクロース層25の最下端に無傷のPBSを仕分ける。PBSの完全性はSDS-PAGE、亜鉛染色、および77K蛍光分光法6、7、8、26によって分析することができる。この方法は、シアノバクテリアから無傷のPBSを分離し、そのスペクトル、構造、および組成特性を研究することを目指す科学者に適しています。
このプロトコルには、いくつかの利点があります。(1)この方法は標準化されており、単細胞および糸状シアノバクテリアの両方から無傷のPBSを単離するために使用することができます。ほとんどの記事は、いずれかのタイプのシアノバクテリア4、7,8,12,13,14,16,18に適用される方法を記載しています。(2)この方法は室温で行い、PBSが低温19,27で解化するようにする。(3) この方法は、ビーズビーターを使用して細胞を破壊する方法を説明します。したがって、それは高圧フランスのプレスよりも安価で安全であり、他の方法で超音波処理器からの損傷を聞く可能性8、13、14、20。(4)この方法は、スクロース勾配超遠心分離により、そのままPBSを分離する。このようにして、異なるサイズおよび部分的に解離したPBSを有する無傷のPBSは、スクロース濃度に基づいて分離することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、シアノバクテリア、単細胞モデルSyn6803、および糸状非モデルJSC-1で無傷のPBSを単離するための簡単で標準的な方法を説明しています。プロトコルの重要なステップは、セルの均質化とスクロースの不連続な密度勾配の超遠心化です。一般的に、糸状細胞の破壊は単細胞細胞よりも複雑である。出発物質の量(細胞ペレットの湿重量)およびビーズ叩きの繰り返し量を増加さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、超遠心分離機の便利な使用のために、国立台湾大学ライフサイエンス大学テクノロジー・コモンズに感謝している。シアノバクテリア株 シネコシスティス sp.PCC 6803と レプトリンビヤ sp.JSC-1は、米国ペンシルベニア州立大学のアカデミア・シニカのチュウ博士、シーウアン、ドナルド・A・ブライアント博士からそれぞれ贈られました。この研究は、理工省(台湾)(109-2636-B-002-013-および110-2628-B-002-065-)と文部省(台湾)の湯山若手学者プログラム(109V11102および110V1102)によって資金提供されました。
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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