Выделение и характеристика интактной фикобилисомы в цианобактериях
Summary
Текущий протокол детализирует выделение фикобилисом из цианобактерий путем центрифугирования через прерывистый градиент плотности сахарозы. Фракции интактных фикобилисом подтверждаются флуоресцентным спектром излучения 77K и анализом SDS-PAGE. Полученные фикобилисомные фракции пригодны для отрицательного окрашивания ТЭМ и масс-спектрометрического анализа.
Abstract
В цианобактериях фикобилисома является жизненно важным антенным белковым комплексом, который собирает свет и передает энергию фотосистеме I и II для фотохимии. Изучение структуры и состава фикобилисом представляет большой интерес для ученых, поскольку выявляет эволюцию и дивергенцию фотосинтеза у цианобактерий. Этот протокол обеспечивает подробный и оптимизированный метод эффективного разрушения цианобактериальных клеток при низких затратах с помощью бисера. Интактная фикобилисома затем может быть выделена из клеточного экстракта путем ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Этот метод продемонстрировал пригодность как для модельных, так и для немодельных цианобактерий с различными типами клеток. Также предусмотрена пошаговая процедура для подтверждения целостности и свойства фикобилипротеинов с помощью флуоресцентной спектроскопии 77K и SDS-PAGE, окрашенных сульфатом цинка и Coomassie Blue. Изолированная фикобилисома также может быть подвергнута дальнейшему структурному и композиционному анализу. В целом, этот протокол обеспечивает полезное начальное руководство, которое позволяет исследователям, незнакомым с цианобактериями, быстро изолировать и охарактеризовать интактную фикобилисому.
Introduction
Фикобилисома (PBS) представляет собой огромный водорастворимый пигментно-белковый комплекс, который прикрепляется к цитоплазматической стороне фотосистем в тилакоидных мембранах цианобактерий1. PBS в основном состоит из цветных фикобилипротеинов и бесцветных линкерных белков1,2. Фикобилипротеины можно разделить на четыре основные группы: фикоэритрин, фикоэритроцианин, фикоцианин и аллофикоцианин3. Четыре основные группы поглощают различные длины волн световой энергии в диапазоне 490-650 нм, которую хлорофиллы поглощали неэффективно3. PBS может служить в качестве светособирающей антенны для сбора световой энергии и доставки ее в Фотосистему II и I4.
Структура и состав PBS варьируются от вида к виду. В совокупности три формы фикобилисомы (гемидискодиальная, пучкообразная и палочковидная) были идентифицированы у разных видов цианобактерий5. Даже у одних и тех же видов состав PBS изменяется в ответ на окружающую среду, например, качество света и истощение питательных веществ6,7,8,9,10,11. Таким образом, экспериментальная процедура выделения PBS из цианобактерий сыграла важную роль в изучении PBS12. В течение нескольких десятилетий множество различных протоколов изолировали PBS и анализировали его структуру, состав и функции6,7,8,12,13,14,15,16,17. Большое разнообразие методов изоляции PBS действительно обеспечивает гибкость в выделении комплекса у разных видов с различными реагентами и инструментами. Тем не менее, это также затрудняет выбор подходящего протокола для ученых, незнакомых с цианобактериями и PBS. Поэтому в этой работе разработан обобщенный и простой протокол для тех, кто заинтересован в запуске выделения PBS из цианобактерий.
Методы изоляции PBS от предыдущих публикаций кратко изложены здесь. Поскольку PBS является водорастворимым белковым комплексом и легко диссоциируется, для стабилизации PBS во время экстракции требуется фосфатный буфер высокой ионной силы18. В прошлом было опубликовано несколько исследовательских статей, описывающих методы выделения PBS из цианобактерий. Большинство методов требуют высокой концентрации фосфатного буфера8,14,15,18,19. Тем не менее, процедуры механического разрушения клеток различаются, такие как экстракция стеклянных шариков, обработка ультразвуком20 и френч-пресс6,8,14. Различные фикобилипротеины могут быть получены путем осаждения сульфатом аммония20 и очищены ВЭЖХ21 или хроматографической колонкой22. С другой стороны, интактный PBS может быть легко выделен ультрацентрифугированием градиента плотности сахарозы6,8,15.
В этом протоколе в качестве материалов для выделения PBS использовались одна модельная цианобактерия и одна немодельная цианобактерия. Это модель одноклеточная глюкозотоустойчивая Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Syn6803) и немодельная нитевидная Leptolyngbya sp. JSC-1 (далее JSC-1), соответственно7,23,24. Протокол начинается с разрушения одноклеточных и нитевидных цианобактерий в фосфатном буфере высокой ионной силы. После лизиса супернатанты собирают центрифугированием, а затем обрабатывают неионным детергентом (Triton X-100) для растворимости водорастворимых белков из тилакоидных мембран. Общие водорастворимые белки наносят на прерывистый градиент плотности сахарозы для фракционирования PBS. Прерывистый градиент сахарозы в этом протоколе состоит из четырех растворов сахарозы и разделяет неповрежденный PBS на самые низкие фракции слоя сахарозы25. Целостность PBS может быть проанализирована с помощью SDS-PAGE, цинкового окрашивания и 77K флуоресцентной спектроскопии6,7,8,26. Этот метод подходит для ученых, которые стремятся выделить неповрежденный PBS из цианобактерий и изучить его спектральные, структурные и композиционные свойства.
Есть несколько преимуществ этого протокола. (1) Этот метод стандартизирован и может быть использован для выделения интактных PBS как из одноклеточных, так и из нитевидных цианобактерий. В большинстве статей описывается метод, применяемый в одном типе цианобактерий4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Этот метод выполняется при комнатной температуре, так как PBS диссоциирует при низкой температуре19,27. (3) Этот метод описывает использование бисерного битера для разрушения клеток; поэтому он дешевле и безопаснее, чем французский пресс высокого давления и возможное повреждение слуха от ультразвукового аппарата другими методами8,13,14,20. (4) Этот метод изолирует интактный PBS путем ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Таким образом, интактные PBS с различными размерами и частично диссоциированные PBS могут быть разделены в зависимости от концентрации сахарозы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный протокол описывает простой и стандартный способ выделения интактной ПБС у двух типов цианобактерий: одноклеточной модели Syn6803 и нитевидной немодельной АО-1. Критическими этапами протокола являются гомогенизация клеток и ультрацентрифугирование на прерывистом градиенте плотн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University за удобное использование ультрацентрифуги. Цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 и Leptolyngbya sp. JSC-1 были подарены доктором Чу, Сю-Аном из Academia Sinica, Тайвань, и доктором Дональдом А. Брайантом из Университета штата Пенсильвания, США, соответственно. Эта работа финансировалась Министерством науки и технологий (Тайвань) (109-2636-B-002-013- и 110-2628-B-002-065-) и Министерством образования (Тайвань) Yushan Young Scholar Program (109V1102 и 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. 생화학. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
