Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias
Summary
El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.
Abstract
En las cianobacterias, el ficobilisoma es un complejo de proteína de antena vital que cosecha luz y transfiere energía al fotosistema I y II para la fotoquímica. El estudio de la estructura y composición del ficobilisoma es de gran interés para los científicos porque revela la evolución y divergencia de la fotosíntesis en las cianobacterias. Este protocolo proporciona un método detallado y optimizado para romper las células de cianobacterias a bajo costo por un batidor de cuentas de manera eficiente. El ficobilisoma intacto se puede aislar del extracto celular mediante ultracentrifugación por gradiente de sacarosa. Este método ha demostrado ser adecuado tanto para cianobacterias modelo como no modelo con diferentes tipos de células. También se proporciona un procedimiento paso a paso para confirmar la integridad y la propiedad de las ficobiliproteínas mediante espectroscopia de fluorescencia 77K y SDS-PAGE teñido por sulfato de zinc y azul coomassie. El ficobilisoma aislado también puede ser sometido a análisis estructurales y compositivos adicionales. En general, este protocolo proporciona una guía de inicio útil que permite a los investigadores que no están familiarizados con las cianobacterias aislar y caracterizar rápidamente el ficobilisoma intacto.
Introduction
El ficobilisoma (PBS) es un enorme complejo pigmentario-proteico soluble en agua que se une al lado citoplasmático de los fotosistemas en las membranas tilacoides de las cianobacterias1. El PBS se compone principalmente de ficobiliproteínas coloreadas y proteínas enlazadoras incoloras1,2. Las ficobiliproteínas se pueden dividir en cuatro grupos principales: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina y aloficocianina3. Los cuatro grupos principales absorben diferentes longitudes de onda de energía lumínica en el rango de 490-650 nm, que las clorofilas absorbieron de manera ineficiente3. El PBS puede servir como una antena de recolección de luz para recolectar energía de la luz y entregarla al Photosystem II e I4.
La estructura y composición de PBS varían de una especie a otra. En conjunto, se han identificado tres formas de ficobilisoma (hemidiscodial, en forma de haz y en forma de varilla) en diferentes especies de cianobacterias5. Incluso en la misma especie, la composición del PBS cambia en respuesta al medio ambiente, como la calidad de la luz y el agotamiento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, el procedimiento experimental para aislar PBS de cianobacterias ha sido fundamental en el estudio de PBS12. Durante varias décadas, muchos protocolos diferentes han aislado PBS y analizado su estructura, composición y función6,7,8,12,13,14,15,16,17. La amplia variedad de métodos para el aislamiento de PBS proporciona flexibilidad para aislar el complejo en diferentes especies con diferentes reactivos e instrumentos. Sin embargo, también hace que la elección de un protocolo adecuado sea más difícil para los científicos que no están familiarizados con las cianobacterias y el PBS. Por lo tanto, se desarrolla un protocolo generalizado y sencillo en este trabajo para aquellos interesados en iniciar el aislamiento de PBS de cianobacterias.
Los métodos para aislar PBS de publicaciones anteriores se resumen aquí. Dado que pbS es un complejo de proteínas solubles en agua y se disocia fácilmente, se requiere un tampón de fosfato de alta fuerza iónica para estabilizar PBS durante la extracción18. Varios artículos de investigación que describen métodos para el aislamiento de PBS de cianobacterias se han publicado en el pasado. La mayoría de los métodos requieren una alta concentración de tampón de fosfato8,14,15,18,19. Sin embargo, los procedimientos para la alteración mecánica de las células varían, como la extracción asistida por perlas de vidrio, la sonicación20 y la prensa francesa6,8,14. Se pueden obtener diferentes ficobiliproteínas por precipitación con sulfato de amonio20 y purificadas por HPLC21 o una columna cromatográfica22. Por otro lado, el PBS intacto se puede aislar fácilmente mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa6,8,15.
En este protocolo, se utilizaron un modelo de cianobacteria y un modelo de cianobacteria no modelo como materiales para el aislamiento de PBS. Son el modelo unicelular tolerante a la glucosa Synechocystis sp. PCC 6803 (en adelante Syn6803) y el no modelo filamentoso Leptolyngbya sp. JSC-1 (en adelante JSC-1), respectivamente7,23,24. El protocolo comienza por la interrupción de las cianobacterias unicelulares y filamentosas en un tampón de fosfato de alta resistencia iónica. Después de la lisis, los sobrenadantes se recogen por centrifugación y luego se tratan con un detergente no iónico (Tritón X-100) para solubilizar las proteínas solubles en agua de las membranas tilacoides. Las proteínas solubles en agua totales se aplican a un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo para fraccionar el PBS. El gradiente de sacarosa discontinua en este protocolo consiste en cuatro soluciones de sacarosa y particiona el PBS intacto en las fracciones más bajas de la capa de sacarosa25. La integridad de PBS se puede analizar mediante SDS-PAGE, tinción de zinc y espectroscopia de fluorescencia 77K6,7,8,26. Este método es adecuado para científicos que tienen como objetivo aislar PBS intacto de cianobacterias y estudiar sus propiedades espectrales, estructurales y de composición.
Hay varias ventajas de este protocolo. (1) Este método está estandarizado y se puede utilizar para aislar PBS intacto de cianobacterias unicelulares y filamentosas. La mayoría de los artículos describen el método que se aplicó en cualquiera de los dos tipos de cianobacterias4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método se realiza a temperatura ambiente, ya que el PBS se disocia a baja temperatura19,27. (3) Este método describe el uso de un batidor de cuentas para interrumpir las células; por lo tanto, es más barato y más seguro que la prensa francesa de alta presión y el posible daño auditivo del sonicador en otros métodos8,13,14,20. (4) Este método aísla PBS intacto por ultracentruga de gradiente de sacarosa. De esta manera, el PBS intacto con diferentes tamaños y PBS parcialmente disociado se puede separar en función de la concentración de sacarosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método simple y estándar para aislar PBS intacto en dos tipos de cianobacterias, el modelo unicelular Syn6803 y el filamentoso no modelo JSC-1. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización celular y la ultracentrifugación en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. En general, la interrupción de las células filamentosas es más complicada que las unicelulares. El aumento de la cantidad del material de partida (el peso húmedo del pellet celular) y la repetición del b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University por el uso conveniente de la ultracentrífuga. Las cepas de cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 y Leptolyngbya sp. JSC-1 fueron donadas por el Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán, y el Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE.UU., respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Taiwán) (109-2636-B-002-013- y 110-2628-B-002-065-) y el Programa de Jóvenes Becarios Yushan del Ministerio de Educación (Taiwán) (109V1102 y 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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