Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af cellulær metabolisme

Summary

Denne protokol beskriver fluorescensbilleddannelse og analyse af de endogene metaboliske coenzymer, reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD). Autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD giver en etiketfri, ikke-destruktiv metode til vurdering af cellulær metabolisme.

Abstract

Cellulær metabolisme er den proces, hvormed celler genererer energi, og mange sygdomme, herunder kræft, er karakteriseret ved unormal metabolisme. Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner. NAD (P) H og FAD udviser autofluorescens og kan spektralt isoleres ved excitation og emissionsbølgelængder. Begge coenzymer, NAD (P) H og FAD, kan eksistere i enten en fri eller proteinbundet konfiguration, som hver især har en særskilt fluorescenslevetid – den tid, hvor fluoroforen forbliver i ophidset tilstand. Fluorescenslevetidsbilleddannelse (FLIM) muliggør kvantificering af fluorescensintensiteten og levetiden for NAD (P) H og FAD til etiketfri analyse af cellulær metabolisme. Fluorescensintensitet og levetidsmikroskoper kan optimeres til billeddannelse af NAD (P) H og FAD ved at vælge de passende excitations- og emissionsbølgelængder. Metaboliske forstyrrelser af cyanid verificerer autofluorescensbilleddannelsesprotokoller for at detektere metaboliske ændringer i celler. Denne artikel vil demonstrere teknikken til autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD til måling af cellulær metabolisme.

Introduction

Metabolisme er den cellulære proces til produktion af energi. Cellulær metabolisme omfatter flere veje, herunder glykolyse, oxidativ fosforylering og glutaminolyse. Sunde celler bruger disse metaboliske veje til at generere energi til spredning og funktion, såsom produktion af cytokiner af immunceller. Mange sygdomme, herunder stofskifteforstyrrelser, kræft og neurodegeneration, er karakteriseret ved ændret cellulær ^metabolisme1. For eksempel har nogle kræftcelletyper forhøjede glykolysehastigheder, selv i nærvær af ilt, for at generere molekyler til syntese af nukleinsyrer, proteiner og ^lipider2,3. Dette fænomen, kendt som Warburg-effekten, er et kendetegn for mange kræfttyper, herunder brystkræft, lungekræft og ^{glioblastomer4}. På grund af ændringerne i cellulær metabolisme forbundet med kræftprogression kan cellulær metabolisme være en surrogatbiomarkør for ^{lægemiddelrespons5,6}. Desuden er forståelse af lægemiddeleffektivitet på celleniveau afgørende, da celleheterogenitet kan føre til forskellige lægemiddelresponser hos ^individer7,8.

Teknologier, der identificerer og kvantificerer ændringer i cellulær metabolisme, er afgørende for undersøgelser af kræft og lægemiddelrespons. Kemiske og proteinanalyser bruges til at evaluere metabolismen af celler eller væv, men mangler enkeltcelleopløsning og rumlig information. Metaboliske pladelæserbaserede assays kan måle pH og iltforbrug i prøven over tid og den efterfølgende metaboliske forstyrrelse af kemikalier. pH kan bruges til at beregne den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR), som giver et indblik i cellernes glykolytiske ^aktivitet9. Helkropsbilleddannelsesmetoder, herunder 2-[fluor-18] fluor-D-glucose positronemissionstomografi (FDG PET) og magnetisk resonansspektroskopi (MRS), er ikke-invasive billeddannelsesmetoder, der anvendes klinisk til at identificere tumorgentagelse og lægemiddeleffektivitet gennem metaboliske målinger10,11,12,13,14.

FDG-PET billeder vævsoptagelsen af FDG, en radioaktivt mærket glukoseanalog. Øget optagelse af FDG-PET af tumorer i forhold til omgivende væv skyldes Warburg-effekten12,13. MRS-billeder af almindelige kerner af molekyler, der anvendes til metabolisme, såsom ^13C og ^31P, og kan få dynamisk information om, hvordan stofskiftet ændres som reaktion på stimuli, såsom motion eller spisning14. Selvom FDG-PET og MRS kan bruges klinisk, mangler disse teknologier den rumlige opløsning til at løse intratumoral heterogenitet. Ligeledes foretages iltforbrugsmålinger på en bulkpopulation af celler. Autofluorescensbilleddannelse overvinder den rumlige opløsningshindring for disse teknologier og giver en ikke-invasiv metode til kvantificering af cellulær metabolisme.

Figur 1: NADH og FAD i fælles metaboliske veje. NADH og FAD er coenzymer, der anvendes i glykolyse, Krebs-cyklussen og elektrontransportkæden. Autofluorescensbilleddannelse af disse molekyler giver information om cellulær metabolisme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner, herunder glycolyse, oxidativ phosphorylering og glutaminolyse (figur 1). Både NAD(P)H og FAD er autofluorescerende og giver endogen kontrast til fluorescensbilleddannelse1,15. NADPH har lignende fluorescerende egenskaber som NADH. På grund af dette bruges NAD (P) H ofte til at repræsentere det kombinerede signal fra NADH og ^NADPH2,16.

Fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) kvantificerer fluorescensens levetid eller den tid, hvor en fluorofor er i ophidset tilstand. Fluorescensens levetid reagerer på fluoroforernes mikromiljø og giver information om cellulær ^{metabolisme17}. NAD(P)H og FAD kan eksistere i celler i enten proteinbundne eller frie konformationer, som hver især har en anden levetid. Fri NAD(P)H har en kortere levetid end proteinbundet NAD(P)H; Omvendt har fri FAD en længere levetid end bundet ^FAD18,19. Levetiden og levetidskomponentvægtene kan kvantificeres ud fra fluorescensens levetidshenfaldsdata gennem Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) repræsenterer den normaliserede fluorescensintensitet som funktion af tiden. De α ₁ og α ₂ i denne ligning repræsenterer de proportionale komponenter i korte og lange levetider (α ₁+ α ₂=1), henholdsvis _τ1 og _τ2 repræsenterer henholdsvis den korte og lange levetid, og C tegner sig for baggrundslys7,20. Den amplitudevægtede levetid, her repræsenteret som _τm, beregnes ved hjælp af Eq. (2).

τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

En gennemsnitlig levetid kan beregnes ved at beregne gennemsnittet af “t” over fluoroforens intensitetshenfald, som for et to-eksponentielt henfald er vist ved Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Et fluorescensintensitetsbillede kan beregnes ud fra livstidsbilledet ved at integrere fluorescensens levetidshenfald. Autofluorescensbilleddannelse er en ikke-destruktiv og etiketfri metode, der kan bruges til at karakterisere metabolismen af levende celler ved en subcellulær opløsning. Det optiske redoxforhold tilvejebringer en optisk analog metrik af cellens kemiske redoxtilstand og beregnes som forholdet mellem NAD (P) H og FAD intensiteter. Selvom formlen til beregning af det optiske redoxforhold ikke er standardiseret22,23,24,25, defineres den her som intensiteten af FAD over de kombinerede intensiteter af NAD (P) H og FAD. Denne definition anvendes, fordi den opsummerede intensitet i nævneren normaliserer metrikken mellem 0 og 1, og det forventede resultat af cyanidhæmningen er et fald i redoxforholdet. Fluorescensleveterne for fri NAD(P)H og FAD giver indsigt i ændringer i det metaboliske opløsningsmiddelmikromiljø, herunder pH, temperatur, nærhed til ilt og osmolaritet17.

Ændringer i fluorescenslevetid for de bundne fraktioner af NAD(P)H og FAD kan indikere udnyttelse af metabolisk vej og substratspecifik ^{metabolisme26}. Komponentvægte kan fortolkes for ændringer i den frie til den bundne brøkdel af ^{coenzymerne18,19}. Alt i alt tillader disse kvantitative autofluorescenslevetidsmålinger analyse af cellulær metabolisme, og autofluorescensbilleddannelse er blevet anvendt til at identificere neoplasmer fra normalt ^væv27,28, karakterisere ^{stamceller29,30}, evaluere immuncellefunktion31,32,33,34,35, måle neurologisk ^{aktivitet36, 37,38} og forståelse af lægemiddeleffektivitet i kræfttyper som brystkræft og hoved- og halskræft21,39,40,41,42. Autofluorescensbilleddannelse i høj opløsning kan kombineres med billedsegmentering til enkeltcelleanalyse og kvantificering af intrapopulationsheterogenitet43,44,45,46,47.

NAD(P)H og FAD kan afbildes på enkeltfoton- eller multifotonfluorescensmikroskoper, der er konfigureret til intensitets- eller levetidsbilleddannelse. For enkeltfotonmikroskoper er NAD(P)H og FAD typisk spændte ved bølgelængder på henholdsvis 375-405 nm og 488 nm på grund af almindelige laserkilder ved disse ^{bølgelængder48}. I to-fotonfluorescens excitation vil NAD (P) H og FAD ophidse ved bølgelængder på henholdsvis ca. 700 til 750 nm og 700 til 900 ^nm15,49. Når fluoroforerne er spændte, udsender NAD (P) H og FAD fotoner ved bølgelængder mellem ~ 410 nm til ~ 490 nm og ~ 510 nm til ~ 640 nm, ^{henholdsvis15}. NAD(P)H- og FAD maxima-emissionsbølgelængderne er henholdsvis ca. 450 nm og 535 ^nm48.

På grund af deres forskellige excitations- og emissionsbølgelængder kan fluorescensen af de to metaboliske coenzymer isoleres spektralt. En forståelse af de spektrale egenskaber ved NAD (P) H og FAD er nødvendig for design og optimering af autofluorescensbilleddannelsesprotokoller. Cyanid er en elektrontransportkæde (ETC) kompleks IV-hæmmer. Virkningerne af cyanid på cellulær metabolisme og autofluorescensintensiteterne og levetiderne for NAD (P) H og FAD i celler er godt ^{karakteriseret27,40}. Derfor er et cyanidforstyrrelseseksperiment et effektivt middel til validering af NAD (P) H- og FAD-billeddannelsesprotokoller. Et vellykket cyanideeksperiment giver tillid til, at NAD (P) H og FAD-billeddannelsesprotokollen kan bruges til at vurdere metabolismen af ukendte grupper eller forstyrrelser.

Protocol

1. Cellebelægning til billeddannelse Aspirer mediet fra en 80-90% sammenflydende T-75-kolbe mcF-7-celler, skyl cellerne med 10 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS), og tilsæt 2 ml 0,25% trypsin (1x) for at løsne cellerne fra kolbebunden. Kolben inkuberes ved 37 °C i ~4 min. Kontroller cellerne under mikroskopet for at bekræfte løsrivelse. Tilsæt straks 8 ml kulturmedium for at deaktivere trypsinen. Saml cellerne i et konisk rør (15 ml eller 50 ml). Tæl c…

Representative Results

Epitelets brystkræftcellelinjen, MCF-7, blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Til fluorescensbilleddannelse blev cellerne podet med en densitet på 4 × 105 celler pr. 35 mm glasbundsbilleddannelsesskål 48 timer før billeddannelse. Cellerne blev afbildet før og efter cyanidbehandling ved hjælp af ovennævnte protokoller. Målet med cyanideeksperimentet er at bekræfte spektralisolering af NAD (P) H og FAD fluorescens og validere billeddannelsessysteme…

Discussion

Autofluorescensintensitet og levetidsbilleddannelse er blevet brugt i vid udstrækning til at vurdere metabolisme i ^celler21,55. FLIM er høj opløsning og løser derfor enkeltceller, hvilket er vigtigt for kræftundersøgelser, fordi cellulær heterogenitet bidrager til tumoraggression og lægemiddelresistens7,39,41,44,45,46,58.^</…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)