Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

Summary

Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming en analyse van de endogene metabole co-enzymen, gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P) H) en geoxideerd flavine-adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD biedt een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme te beoordelen.

Abstract

Cellulair metabolisme is het proces waarbij cellen energie genereren en veel ziekten, waaronder kanker, worden gekenmerkt door een abnormaal metabolisme. Gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD(P)H) en geoxideerd flavine adenine dinucleotide (FAD) zijn co-enzymen van metabole reacties. NAD(P)H en FAD vertonen autofluorescentie en kunnen spectraal worden geïsoleerd door excitatie- en emissiegolflengten. Beide co-enzymen, NAD(P)H en FAD, kunnen bestaan in een vrije of eiwitgebonden configuratie, die elk een verschillende fluorescentielevensduur hebben – de tijd gedurende welke de fluorofoor in de aangeslagen toestand blijft. Fluorescentie lifetime imaging (FLIM) maakt kwantificering van de fluorescentie-intensiteit en levensduur van NAD(P)H en FAD mogelijk voor labelvrije analyse van cellulair metabolisme. Fluorescentie-intensiteit en levensduurmicroscopen kunnen worden geoptimaliseerd voor beeldvorming van NAD (P) H en FAD door de juiste excitatie- en emissiegolflengten te selecteren. Metabole verstoringen door cyanide verifiëren autofluorescentie beeldvormingsprotocollen om metabole veranderingen in cellen te detecteren. Dit artikel demonstreert de techniek van autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD voor het meten van cellulair metabolisme.

Introduction

Metabolisme is het cellulaire proces van het produceren van energie. Cellulair metabolisme omvat meerdere routes, waaronder glycolyse, oxidatieve fosforylering en glutaminolyse. Gezonde cellen gebruiken deze metabole routes om energie te genereren voor proliferatie en functie, zoals de productie van cytokines door immuuncellen. Veel ziekten, waaronder metabole stoornissen, kanker en neurodegeneratie, worden gekenmerkt door een veranderd cellulair ^metabolisme1. Sommige soorten kankercellen hebben bijvoorbeeld verhoogde glycolysesnelheden, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof, om moleculen te genereren voor de synthese van nucleïnezuren, eiwitten en ^lipiden2,3. Dit fenomeen, bekend als het Warburg-effect, is een kenmerk van vele soorten kanker, waaronder borstkanker, longkanker en glioblastomen4. Vanwege de veranderingen van het cellulaire metabolisme geassocieerd met kankerprogressie, kan cellulair metabolisme een surrogaatbiomarker zijn voor ^{medicijnrespons5,6}. Bovendien is het begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen op cellulair niveau cruciaal, omdat celheterogeniteit kan leiden tot verschillende geneesmiddelresponsen bij ^{individuen7,8}.

Technologieën die veranderingen in het cellulaire metabolisme identificeren en kwantificeren, zijn essentieel voor studies naar kanker en medicijnrespons. Chemische en eiwitanalyses worden gebruikt om het metabolisme van cellen of weefsels te evalueren, maar missen eencellige resolutie en ruimtelijke informatie. Metabole plaatlezer-gebaseerde assays kunnen de pH en het zuurstofverbruik in het monster in de loop van de tijd en de daaropvolgende metabole verstoring door chemicaliën meten. De pH kan worden gebruikt om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) te berekenen, wat inzicht geeft in de glycolytische activiteit van de ^cellen9. Beeldvormingsmethoden voor het hele lichaam, waaronder 2-[fluor-18] fluor-D-glucose positronemissietomografie (FDG PET) en magnetische resonantiespectroscopie (MRS), zijn niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten die klinisch worden gebruikt om tumorrecidief en werkzaamheid van geneesmiddelen te identificeren door middel van metabole metingen10,11,12,13,14.

FDG-PET brengt de weefselopname van FDG in beeld, een radioactief gelabeld glucose-analoog. Verhoogde opname van FDG-PET door tumoren ten opzichte van het omliggende weefsel is te wijten aan het Warburg-effect12,13. MRS toont gemeenschappelijke kernen van moleculen die worden gebruikt voor het metabolisme, zoals ^13C en ^31P, en kan dynamische informatie verkrijgen over hoe het metabolisme verandert als reactie op stimuli, zoals lichaamsbeweging of ^eten14. Hoewel FDG-PET en MRS klinisch kunnen worden gebruikt, missen deze technologieën de ruimtelijke resolutie om intratumorale heterogeniteit op te lossen. Evenzo worden metingen van het zuurstofverbruik uitgevoerd op een bulkpopulatie van cellen. Autofluorescentie beeldvorming overwint het ruimtelijke resolutie obstakel van deze technologieën en biedt een niet-invasieve methode voor het kwantificeren van cellulair metabolisme.

Figuur 1: NADH en FAD in gemeenschappelijke metabole routes. NADH en FAD zijn co-enzymen die worden gebruikt in glycolyse, de Krebs-cyclus en de elektronentransportketen. Autofluorescentie beeldvorming van deze moleculen geeft informatie over cellulair metabolisme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P)H) en geoxideerd flavine adenine dinucleotide (FAD) zijn co-enzymen van metabole reacties, waaronder glycolyse, oxidatieve fosforylering en glutaminolyse (figuur 1). Zowel NAD(P)H als FAD zijn autofluorescent en bieden endogene contrast voor fluorescentiebeeldvorming1,15. NADPH heeft vergelijkbare fluorescerende eigenschappen als NADH. Daarom wordt NAD(P)H vaak gebruikt om het gecombineerde signaal van NADH en NADPH2,16 ^{weer te geven}.

Fluorescence lifetime imaging (FLIM) kwantificeert de fluorescentielevensduur of de tijd waarvoor een fluorofoor zich in de aangeslagen toestand bevindt. Fluorescentielevensduur reageert op de micro-omgeving van de fluoroforen en geeft informatie over cellulair ^{metabolisme17}. NAD(P)H en FAD kunnen in cellen bestaan in eiwitgebonden of vrije conformaties, die elk een andere levensduur hebben. Vrije NAD(P)H heeft een kortere levensduur dan eiwitgebonden NAD(P)H; omgekeerd heeft vrije FAD een langere levensduur dan gebonden ^FAD18,19. De levensduur en het gewicht van de levensduurcomponenten kunnen worden gekwantificeerd op basis van gegevens over het levensduurverval van fluorescentie via Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) vertegenwoordigt de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit als functie van de tijd. De α ₁ en α ₂ in deze vergelijking vertegenwoordigen de proportionele componenten van korte en lange levensduur (respectievelijk α ₁+ α ₂=1), respectievelijk _τ1 en _τ2 vertegenwoordigen respectievelijk de korte en lange levensduur, en C is goed voor ^{achtergrondlicht7,20}. De amplitudegewogen levensduur, hier weergegeven als _τm, wordt berekend met eq. (2).

_τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

Een gemiddelde levensduur kan worden berekend door het gemiddelde van “t” over het intensiteitsverval van de fluorofoor, wat voor een twee-exponentieel verval wordt aangetoond door Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Een fluorescentie-intensiteitsbeeld kan worden berekend uit het levensduurbeeld door het fluorescentielevensverval te integreren. Autofluorescentie beeldvorming is een niet-destructieve en labelvrije methode die kan worden gebruikt om het metabolisme van levende cellen met een subcellulaire resolutie te karakteriseren. De optische redoxverhouding biedt een optische analoge metriek van de chemische redoxtoestand van de cel en wordt berekend als de verhouding van NAD(P)H- en FAD-intensiteiten. Hoewel de formule voor het berekenen van de optische redoxverhouding niet gestandaardiseerd is22,23,24,25, wordt deze hier gedefinieerd als de intensiteit van FAD over de gecombineerde intensiteiten van NAD(P)H en FAD. Deze definitie wordt gebruikt omdat de opgetelde intensiteit in de noemer de metriek tussen 0 en 1 normaliseert, en het verwachte resultaat van de cyanideremming een afname van de redoxverhouding is. De fluorescentielevensduur van vrije NAD(P)H en FAD geeft inzicht in veranderingen in de micro-omgeving van het metabole oplosmiddel, waaronder pH, temperatuur, nabijheid van zuurstof en ^{osmolariteit17}.

Veranderingen in de fluorescentielevensduur van de gebonden fracties van NAD(P)H en FAD kunnen wijzen op het gebruik van metabole routes en substraatspecifiek ^{metabolisme26}. Componentgewichten kunnen worden geïnterpreteerd voor veranderingen in de vrije tot de gebonden fractie van de ^{co-enzymen18,19}. Al met al maken deze kwantitatieve autofluorescentielevensduurmetingen de analyse van cellulair metabolisme mogelijk, en autofluorescentiebeeldvorming is gebruikt voor het identificeren van neoplasmata uit normale ^{weefsels27,28}, het karakteriseren van ^{stamcellen29,30}, het evalueren van de immuuncelfunctie31,32,33,34,35, het meten van neurologische ^{activiteit36, 37,38}, en inzicht in de werkzaamheid van geneesmiddelen bij kankersoorten zoals borstkanker en hoofd-halskanker21,39,40,41,42. Hoge-resolutie autofluorescentie beeldvorming kan worden gecombineerd met beeldsegmentatie voor eencellige analyse en kwantificering van intrapopulatie heterogeniteit43,44,45,46,47.

NAD(P)H en FAD kunnen worden afgebeeld op fluorescentiemicroscopen met één foton of multifotonen die zijn geconfigureerd voor intensiteits- of levenslange beeldvorming. Voor microscopen met één foton worden NAD(P)H en FAD meestal geëxciteerd op golflengten van respectievelijk 375-405 nm en 488 nm, als gevolg van gemeenschappelijke laserbronnen op deze ^{golflengten48}. Bij fluorescentie-excitatie van twee fotonen zullen NAD(P)H en FAD exciteren op golflengten van respectievelijk ongeveer 700 tot 750 nm en 700 tot 900 nm, ^15,49. Zodra de fluoroforen zijn geëxciteerd, zenden NAD(P)H en FAD fotonen uit op golflengten tussen respectievelijk ~410 nm tot ~490 nm en ~510 nm tot ~640 ^nm15. De NAD(P)H en FAD maxima emissie golflengten zijn respectievelijk ongeveer 450 nm en 535 ^nm48.

Vanwege hun verschillende excitatie- en emissiegolflengten kan de fluorescentie van de twee metabole co-enzymen spectraal worden geïsoleerd. Een goed begrip van de spectrale kenmerken van NAD(P)H en FAD is noodzakelijk voor het ontwerp en de optimalisatie van autofluorescentie beeldvormingsprotocollen. Cyanide is een elektronentransportketen (ETC) complexe IV-remmer. De effecten van cyanide op het cellulair metabolisme en de autofluorescentie-intensiteiten en levensduur van NAD(P)H en FAD in cellen worden goed gekarakteriseerd27,40. Daarom is een cyanide perturbatie-experiment een effectief middel om NAD(P)H- en FAD-beeldvormingsprotocollen te valideren. Een succesvol cyanide-experiment geeft vertrouwen dat het NAD(P)H- en FAD-beeldvormingsprotocol kan worden gebruikt om het metabolisme van onbekende groepen of verstoringen te beoordelen.

Protocol

1. Cell plating voor beeldvorming Zuig het medium op uit een 80-90% confluent T-75 kolf van MCF-7 cellen, spoel de cellen met 10 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 2 ml 0,25% trypsine (1x) toe om de cellen los te maken van de kolfbodem. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende ~4 min. Controleer de cellen onder de microscoop om de onthechting te bevestigen. Voeg onmiddellijk 8 ml kweekmedium toe om de trypsine te deactiveren. Verzamel de cellen…

Representative Results

De epitheliale borstkanker cellijn, MCF-7, werd gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Voor fluorescentiebeeldvorming werden de cellen gezaaid met een dichtheid van 4 × 105 cellen per 35 mm glazen bodembeeldschotel 48 uur vóór beeldvorming. De cellen werden voor en na de behandeling met cyanide in beeld gebracht met behulp van de hierboven vermelde protocollen. Het doel van het cyanide-experiment is om spectrale isolatie van NAD(P)H- en FAD-fluorescenti…

Discussion

Autofluorescentie-intensiteit en levenslange beeldvorming zijn op grote schaal gebruikt om het metabolisme in cellen te ^{beoordelen21,55}. FLIM heeft een hoge resolutie en lost daarom afzonderlijke cellen op, wat belangrijk is voor kankerstudies omdat cellulaire heterogeniteit bijdraagt aan tumoragressie en medicijnresistentie7,39,41,44,45,46,58.<sup class="xref…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)