Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Anna Theodossiou; Linghao Hu; Nianchao Wang; Uyen Nguyen; Alex J. Walsh

doi:10.3791/63282

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생체공학

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

Published: November 15, 2021

doi:

10.3791/63282

Anna Theodossiou, Linghao Hu, Nianchao Wang, Uyen Nguyen, Alex J. Walsh

¹Department of Biomedical Engineering,Texas A&M University-College Station

Summary

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。

Abstract

細胞代謝は細胞がエネルギーを生成するプロセスであり、癌を含む多くの疾患は異常な代謝によって特徴付けられる。還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、代謝反応の補酵素である。NAD(P)HおよびFADは自己蛍光を示し、励起および発光波長によってスペクトル的に単離することができる。両方の補酵素、NAD(P)HおよびFADは、遊離またはタンパク質結合配置のいずれかで存在することができ、それぞれが異なる蛍光寿命(蛍光色素分子が励起状態にとどまる時間)を有する。蛍光寿命イメージング(FLIM)は、細胞代謝の標識のない分析のために、NAD(P)HおよびFADの蛍光強度および寿命の定量化を可能にする。蛍光強度と寿命顕微鏡は、適切な励起波長と発光波長を選択することで、NAD(P)HとFADのイメージングに最適化できます。シアン化物による代謝摂動は、細胞内の代謝変化を検出するための自己蛍光イメージングプロトコルを検証します。本稿では、細胞代謝を測定するためのNAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージング技術を実証する。

Introduction

代謝は、エネルギーを生産する細胞プロセスです。細胞代謝は、解糖系、酸化的リン酸化、およびグルタミン分解を含む複数の経路を包含する。健康な細胞は、これらの代謝経路を使用して、免疫細胞によるサイトカインの産生などの増殖および機能のためのエネルギーを生成する。代謝障害、癌、神経変性を含む多くの疾患は、細胞代謝の変化によって特徴付けられます¹。例えば、一部のがん細胞型は、酸素の存在下でも解糖系の割合が上昇し、核酸、タンパク質、および脂質を合成するための分子を生成します^2,3。ウォーバーグ効果として知られるこの現象は、乳がん、肺がん、膠芽腫など、多くのがんタイプの特徴です⁴。がんの進行に伴う細胞代謝の変化のため、細胞代謝は薬物応答の代理バイオマーカーとなり得る^5,6。さらに、細胞の不均一性は個人において異なる薬物応答につながる可能性があるため、細胞レベルで薬物の有効性を理解することは極めて重要です^7,8。

細胞代謝の変化を同定および定量化する技術は、がんおよび薬物応答の研究に不可欠です。化学分析およびタンパク質分析は、細胞または組織の代謝を評価するために使用されますが、単一細胞分解能および空間情報が不足しています。代謝プレートリーダーベースのアッセイは、経時的にサンプル中のpHおよび酸素消費量、およびその後の化学物質による代謝摂動を測定することができる。pHを使用して細胞外酸性化率(ECAR)を計算することができ、細胞の解糖系活性に関する洞察が得られます⁹。2-[フッ素-18]フルオロ-D-グルコース陽電子放射断層撮影法(FDG PET)および磁気共鳴分光法(MRS)を含む全身イメージング法は、代謝測定を通じて腫瘍の再発および薬物有効性を同定するために臨床的に使用される非侵襲的イメージングモダリティである^{10,11,12,13,14}。

FDG-PETは、放射性標識グルコース類似体であるFDGの組織取り込みを画像化する。周囲の組織に対する腫瘍によるFDG-PETの取り込みの増加は、ウォーバーグ効果によるものである^12,13。MRSは、^13Cや^31Pなどの代謝に使用される分子の一般的な核を画像化し、運動や食事などの刺激に応答して代謝がどのように変化するかについての動的情報を得ることができます¹⁴。FDG-PETおよびMRSは臨床的に使用することができるが、これらの技術は腫瘍内の不均一性を解決するための空間分解能を欠いている。同様に、酸素消費量の測定は、大量の細胞集団に対して行われます。自己蛍光イメージングは、これらの技術の空間分解能の障害を克服し、細胞代謝を定量化する非侵襲的な方法を提供します。

図1:一般的な代謝経路におけるNADHおよびFAD。 NADHおよびFADは、解糖系、クレブスサイクル、および電子輸送鎖に使用される補酵素である。これらの分子の自己蛍光イメージングは、細胞代謝に関する情報を提供する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、解糖系、酸化的リン酸化系、グルタミン分解系などの代謝反応の補酵素です(図1)。NAD(P)HとFADはどちらも自己蛍光性であり、蛍光イメージングに内因性のコントラストを提供します^1,15。NADPHはNADHと同様の蛍光特性を有する。このため、NAD(P)H は、NADH と NADPH2,16 の結合信号を表すためによく使用されます。

蛍光寿命イメージング(FLIM)は、蛍光寿命または蛍光色素分子が励起状態にある時間を定量化します。蛍光の寿命は蛍光色素分子の微小環境に反応し、細胞代謝に関する情報を提供します¹⁷。NAD(P)HおよびFADは、タンパク質結合または遊離立体配座のいずれかで細胞内に存在することができ、それぞれが異なる寿命を有する。遊離NAD(P)Hは、タンパク質結合NAD(P)Hよりも寿命が短い。逆に、遊離FADは束縛されたFADよりも寿命が長い^18,19。寿命および寿命成分の重みは、蛍光寿命減衰データから式(1)²⁰を通して定量化することができる。

I(t) = α _1e-t/τ1 + α 2e-t^/_τ2 + C (1)

式(1)は、時間の関数として規格化された蛍光強度を表す。この式のα ₁とα ₂は、それぞれ短寿命と長寿命(α ₁+α ₂=1)の比例成分を表し、_τ1と_τ2はそれぞれ短寿命と長寿命を表し、Cは背景光^7,20を表します。振幅加重寿命は、ここでは_τmとして表され、式(2)を使用して計算されます。

_τm= α _1τ1+ α _2τ2 (₂)

平均寿命は、蛍光色素分子の強度減衰に対して「t」を平均することによって計算することができ、2指数関数的な減衰の場合、式(3)^17,21で示されます。

τ*_m= (α 1τ12+ α ^2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

蛍光強度画像は、蛍光寿命減衰を積分することにより、寿命画像から計算することができる。自己蛍光イメージングは、生細胞の代謝を細胞内分解能で特徴付けるために使用できる非破壊的で標識のない方法です。光酸化還元比は、セルの化学的酸化還元状態の光学アナログ測定を提供し、NAD(P)HとFAD強度の比として計算されます。光学酸化還元比の計算式は標準化されていません^{が22,23,24,25}^,^ここではNAD(P)HとFADを合わせた強度に対するFADの強度と定義しています。この定義が使用されるのは、分母の強度の合計がメトリックを 0 ~ 1 の間で正規化し、シアン化物阻害の予想される結果が酸化還元比の減少であるためです。遊離NAD(P)HおよびFADの蛍光寿命は、pH、温度、酸素への近接性、浸透圧など、代謝溶媒微小環境の変化に関する洞察を提供します¹⁷。

NAD(P)HとFADの結合画分の蛍光寿命の変化は、代謝経路の利用と基質特異的代謝を示す可能性があります²⁶。成分重量は、補酵素の遊離から結合画分への変化について解釈することができる¹⁸^、¹⁹。全体として、これらの定量的自己蛍光寿命測定基準は、細胞代謝の分析を可能にし、自己蛍光イメージングは、正常組織からの新生物^{の同定27,28}、幹細胞の特性評価^29,30、免疫細胞機能の評価^{31,32,33,34,35}、神経学的活性の測定³⁶^、 37^、³⁸、および乳癌および頭頸部癌などの癌タイプにおける薬物有効性を理解する21、³⁹、40、⁴¹^、⁴²。高解像度の自己蛍光イメージングは、単一細胞分析および集団内不均一性の定量化のための画像セグメンテーションと組み合わせることができます^{43,44,45,46,47}。

NAD(P)HおよびFADは、強度または寿命イメージング用に構成された単一光子または多光子蛍光顕微鏡でイメージングできます。単一光子顕微鏡の場合、NAD(P)HとFADは、これらの波長で共通のレーザー光源のために、それぞれ375-405nmと488nmの波長で励起されるのが一般的です⁴⁸。2光子蛍光励起では、NAD(P)HとFADはそれぞれ約700~750nmと700~900nmの波長で励起します^15,49。蛍光色素分子が励起されると、NAD(P)HおよびFADは、それぞれ~410 nm~~490 nmおよび~510 nm~~640 nmの波長で光子を放出します¹⁵。NAD(P)HおよびFADの最大発光波長は、それぞれ約450nmおよび535nmである⁴⁸。

励起波長と発光波長が異なるため、2つの代謝補酵素の蛍光をスペクトル的に単離することができます。NAD(P)HおよびFADのスペクトル特性を理解することは、自己蛍光イメージングプロトコルの設計および最適化に必要です。シアン化物は電子輸送鎖(ETC)錯体IV阻害剤である。細胞代謝に対するシアン化物の影響、ならびに細胞内のNAD(P)HおよびFADの自己蛍光強度および寿命は、よく特徴付けられる^27,40。したがって、シアン化物摂動実験は、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを検証するための有効な手段である。シアン化物実験が成功すれば、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを使用して未知のグループまたは摂動の代謝を評価できるという確信が得られます。

Protocol

1. イメージング用セルプレーティング MCF-7細胞の80〜90%コンフルエントT−75フラスコから培地を吸引し、10mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎ、2mLの0.25%トリプシン(1x)を加えて細胞をフラスコ底部から剥離する。フラスコを37°Cで約4分間インキュベートする。顕微鏡で細胞を確認し、剥離を確認します。直ちに8mLの培養液を加え、トリプシン?…

Representative Results

上皮乳癌細胞株MCF-7を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM中で培養した。蛍光画像化のために、細胞を、画像化の48時間前に35mmガラス底画像化皿当たり4×105細胞の密度で播種した。細胞をシアン化物処理の前後に、上記のプロトコールを用いて画像化した。シアン化物実験の目的は、NAD(P)HおよびFAD蛍光のスペクトル分離を確認し、細胞の代謝?…

Discussion

自己蛍光強度および寿命イメージングは、細胞における代謝を評価するために広く使用されている^21,55。FLIMは高分解能であり、したがって単一細胞を解決し、細胞の不均一性が腫瘍の攻撃性および薬剤耐性に寄与するため、癌研究にとって重要である7,39,41,44,45,46,58。<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

資金源には、Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) とTexas A&M Universityが含まれる。 図 1 は、BioRender.com を使用して作成されました。

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)

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Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).