Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer
Summary
Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.
Abstract
Das primäre Cilium ist eine kritische Signalorganelle, die auf fast jeder Zelle vorkommt, die Hedgehog (Hh) -Signalreize von der Zelloberfläche überträgt. Im Granulatzellvorläufer (GCP) fungiert das primäre Cilium als zentrales Signalzentrum, das die Proliferation von Vorläuferzellen orchestriert, indem es den Hh-Signalweg moduliert. Die Untersuchung der primären Cilium-abhängigen Hh-Signalmaschinerie wird durch in vitro genetische Manipulation der Signalwegkomponenten erleichtert, um ihre dynamische Lokalisierung zum primären Cilium sichtbar zu machen. Die Transfektion von Transgenen in den Primärkulturen von GCPs unter Verwendung der derzeit bekannten Elektroporationsmethoden ist jedoch im Allgemeinen kostspielig und führt häufig zu einer geringen Zelllebensfähigkeit und unerwünschten Transfektionseffizienz. Dieses Papier stellt ein effizientes, kostengünstiges und einfaches Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Transfektionseffizienz von ~ 80-90% und eine optimale Zelllebensfähigkeit aufweist. Dies ist eine einfache, reproduzierbare und effiziente genetische Modifikationsmethode, die auf die Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs in primären GCP-Kulturen anwendbar ist.
Introduction
Kleinhirn-GCPs werden häufig verwendet, um die Maschinerie des Hh-Signalwegs in neuronalen Vorläuferzelltypen aufgrund ihrer hohen Häufigkeit und hohen Empfindlichkeit gegenüber dem Hh-Signalweg in vivo zu untersuchen1,2,3,4. In GCPs fungiert das primäre Cilium als pivotaler Hh-Signaltransduktionshub5, der die Proliferation der Vorläuferzellen orchestriert6,7,8. Die In-vitro-Visualisierung von Hh-Signalkomponenten auf dem primären Cilium ist aufgrund ihrer niedrigen endogenen Basalspiegel oft eine Herausforderung. Daher sind die transgene Modifikation der Proteinexpressionsniveaus und die Fluorophormarkierung des interessierenden Gens nützliche Ansätze, um den Signalweg bei molekularer Auflösung zu untersuchen. Die genetische Manipulation von GCP-Primärkulturen unter Verwendung von Liposomen-basierten Transfektionsansätzen führt jedoch häufig zu einer geringen Transfektionseffizienz, was weitere molekulare Untersuchungen behindert9. Die Elektroporation erhöht die Effizienz, erfordert jedoch in der Regel exorbitante herstellerspezifische und zelltypbeschränkte Elektroporationsreagenzien10.
In diesem Artikel wird eine hocheffiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Manipulation der Hh-Signalwegkomponenten in GCP-Primärkulturen vorgestellt. Mit diesem modifizierten Elektroporationsprotokoll wurde ein mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiertes smoothened transgene (pEGFP-Smo) effizient an GCPs abgegeben und erreichte hohe Zellüberlebens- und Transfektionsraten (80-90%). Darüber hinaus zeigten die transfizierten GCPs, wie durch die immunzytochemische Färbung belegt, eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der durch Geglätteten Agonisten induzierten Aktivierung des Hh-Signalwegs durch den Transport von EGFP-Smo zu den primären Zilien. Dieses Protokoll ist unmittelbar anwendbar und vorteilhaft für Experimente, die eine genetische In-vitro-Veränderung von schwer zu transfizierenden Zelltypen wie Primärzellkulturen für Menschen und Nagetiere sowie vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen beinhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Transfektion von Transgenen in primärer GCP-Kultur durch Elektroporationsmethode ist typischerweise mit einer geringen Zelllebensfähigkeit und einer schlechten Transfektionseffizienz assoziiert9,10. Dieses Papier stellt ein kostengünstiges und reproduzierbares Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Effizienz und Lebensfähigkeit bewiesen hat. Darüber hinaus demonstrieren wir auch eine einfache Methode zur Untersuchung des primären Cilium-abhängige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch den HKBU Seed Fund und den Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), den Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) an C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
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