Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model
Summary
Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.
Abstract
Perifere arteriële ziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit als gevolg van chronische blootstelling aan atherosclerotische risicofactoren. Patiënten die lijden aan de meest ernstige vorm, chronische ledemaatbedreigende ischemie (CLTI), worden geconfronteerd met aanzienlijke beperkingen in het dagelijks leven, waaronder chronische pijn, beperkte loopafstand zonder pijn en niet-genezende wonden. Preklinische modellen zijn ontwikkeld bij verschillende dieren om PAD te bestuderen, maar muis hindlimb ischemie blijft de meest gebruikte. Er kan een aanzienlijke variatie zijn in reactie op ischemische belediging in deze modellen, afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de plaats, het aantal en de middelen van arteriële verstoring. Dit protocol beschrijft een unieke methode die femorale slagader en ader elektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthase (NOS) -remmer om op betrouwbare wijze voetzoolgangreen te induceren in Friend Virus B (FVB) muizen die lijken op het weefselverlies van CLTI. Terwijl traditionele middelen voor het beoordelen van reperfusie zoals laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI) nog steeds worden aanbevolen, wordt intracardiale perfusie van de lipofiele kleurstof 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI) gebruikt om de vasculatuur te labelen. Daaropvolgende confocale laserscanmicroscopie met volledige mount maakt een hoge resolutie, driedimensionale (3D) reconstructie van voetkussen vasculaire netwerken mogelijk die een aanvulling vormt op traditionele middelen om reperfusie in hindlimb ischemiemodellen te beoordelen.
Introduction
Perifere arteriële ziekte (PAD), gekenmerkt door verminderde bloedtoevoer naar de ledematen als gevolg van atherosclerose, treft 6,5 miljoen mensen in de Verenigde Staten en 200 miljoen mensen wereldwijd1. Patiënten met PAD ervaren een verminderde ledemaatfunctie en kwaliteit van leven, en degenen met CLTI, de meest ernstige vorm van PAD, lopen een verhoogd risico op amputatie en overlijden met een 5-jarig sterftecijfer van bijna 50%2. In de klinische praktijk worden patiënten met enkel-brachiale indices (ABI) <0,9 geacht PAD te hebben, en patiënten met ABI <0,4 geassocieerd met rustpijn of weefselverlies als clti3. De symptomen variëren tussen patiënten met vergelijkbare ABI’s, afhankelijk van de dagelijkse activiteit, spiertolerantie voor ischemie, anatomische variaties en verschillen in collaterale ontwikkeling4. Cijfer- en ledemaatgangreen is de meest ernstige manifestatie van alle vasculaire occlusieve ziekten die resulteren in CLTI. Het is een vorm van droge necrose die de zachte weefsels mummifieert. Naast atherosclerotisch PAD kan het ook worden waargenomen bij patiënten met diabetes, vasculiciden zoals de ziekte van Buerger en het fenomeen van Raynaud, of calcifylaxie in de setting van nierziekte in het eindstadium5,6.
Verschillende preklinische modellen zijn ontwikkeld om de pathogenese van PAD /CLTI te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen te testen, waarvan de meest voorkomende muisachterlimb ischemie blijft. Het induceren van hindlimb ischemie bij muizen wordt meestal bereikt door de obstructie van de bloedstroom uit de iliacale of femorale slagaders, hetzij door hechtingsligatie, elektrocoagulatie of andere middelen om het gewenste vat te vernauwen7. Deze technieken verminderen de perfusie naar de achterpoot drastisch en stimuleren neovascularisatie in de dij- en kuitspieren. Er zijn echter essentiële muriene stamafhankelijke verschillen in gevoeligheid voor ischemische belediging, deels als gevolg van anatomische verschillen in collaterale verdeling8,9. C57BL/6-muizen zijn bijvoorbeeld relatief resistent tegen ischemie van de hindlimb, wat een verminderde ledemaatfunctie aantoont, maar over het algemeen geen bewijs van gangreen in het voetkussen. Aan de andere kant hebben BALB / c-muizen een inherent slecht vermogen om te herstellen van ischemie en ontwikkelen ze meestal auto-amputatie van de voet of het onderbeen na alleen ligatie van de dijbeenslagader. Deze ernstige reactie op ischemie vernauwt het therapeutische venster en kan longitudinale beoordeling van ledemaatreperfusie en -functie uitsluiten. Interessant is dat genetische verschillen in een enkele kwantitatieve eigenschap locus op murinechromosoom 7 betrokken zijn bij deze differentiële gevoeligheid van C57BL / 6 en BALB / c muizen voor weefselnecrose en ledemaatreperfusie10.
Vergeleken met C57BL/6- en BALB/c-stammen vertonen FVB-muizen een intermediaire maar inconsistente respons op alleen ligatie van de dijbeenslagader. Sommige dieren ontwikkelen voetpad gangreen in de vorm van zwarte ischemische nagels of gemummificeerde cijfers, weer anderen zonder openlijke tekenen van ischemie11. Gelijktijdige toediening van Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride (L-NAME), een stikstofmonoxidesynthase (NOS)-remmer12, voorkomt compenserende vaatverwijdende mechanismen en verhoogt verder oxidatieve stress in achterhandweefsel. In combinatie met ligatie of stolling van de femorale slagader produceert deze aanpak consequent verlies van voetzoolweefsel bij FVB-muizen dat lijkt op de atrofische veranderingen van CLTI, maar zelden evolueert naar auto-amputatie van ledematen11. Oxidatieve stress is een van de kenmerken van PAD/CLTI en wordt vermeerderd door endotheeldisfunctie en verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide (NO)13,14. NO is een pluripotent molecuul dat gewoonlijk gunstige effecten uitoefent op de arteriële en capillaire bloedstroom, de hechting en aggregatie van bloedplaatjes en de rekrutering en activering van leukocyten13. Van verlaagde NOS is ook aangetoond dat het het angiotensine-converterende enzym activeert, dat oxidatieve stress induceert en de progressie van atherosclerose versnelt15.
Zodra een model van hindlimb ischemie is vastgesteld, zijn monitoring van de daaropvolgende ledemaatreperfusie en het therapeutische effect van mogelijke behandelingen ook nodig. In het voorgestelde muriene gangreenmodel kan de mate van weefselverlies eerst worden gekwantificeerd met behulp van de Faber-score om het bruto uiterlijk van de voet te beoordelen (0: normaal, 1-5: verlies van nagels waarbij de score het aantal aangetaste nagels vertegenwoordigt, 6-10: atrofie van cijfers waarbij de score het aantal aangetaste cijfers vertegenwoordigt, 11-12: gedeeltelijke en volledige voetatrofie, respectievelijk)9. Kwantitatieve metingen van hindlimbperfusie worden vervolgens meestal uitgevoerd met behulp van LDPI, dat afhankelijk is van Doppler-interacties tussen laserlicht en rode bloedcellen om perfusie op pixelniveau aan te geven in een interessegebied (ROI)16. Hoewel deze techniek kwantitatief, niet-invasief en ideaal is voor herhaalde metingen, biedt het geen korrelige anatomische details van de achterste vasculatuur16. Andere beeldvormingsmodaliteiten, zoals micro-computertomografie (micro-CT), magnetische resonantieangiografie (MRA) en röntgenmicroangiografie, blijken ofwel kostbaar, vereisen geavanceerde instrumentatie of anderszins technisch uitdagend16. In 2008 beschreven Li et al. een techniek voor het labelen van bloedvaten in het netvlies met de lipofiele carbocyaninekleurstof DiI17. DiI integreert in endotheelcellen en kleurt door directe diffusie vasculaire membraanstructuren zoals angiogene spruiten en pseudopodale processen17,18. Vanwege de directe afgifte in endotheelcellen en de zeer fluorescerende aard van de kleurstof, biedt deze procedure intense en langdurige etikettering van bloedvaten. In 2012 pasten Boden et al. de techniek van DiI-perfusie aan het murine hindlimb ischemia-model aan via whole-mount imaging van geoogste dij-adductorspieren na ligatie van de femorale slagader19.
De huidige methode biedt een relatief goedkope en technisch haalbare manier om neovascularisatie te beoordelen als reactie op hindlimb ischemie en gen- of celgebaseerde therapieën. In een verdere aanpassing beschrijft dit protocol de toepassing van DiI-perfusie om de voetzoolvasculatuur in hoge resolutie en 3D in een murinemodel van hindlimb gangreen in beeld te brengen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel muis hindlimb ischemie het meest gebruikte preklinische model is om neovascularisatie in PAD en CLTI te bestuderen, is er een significante variatie in de ernst en het herstel van ischemie, afhankelijk van de specifieke muisstam die wordt gebruikt en de plaats, het aantal en de methode van arteriële verstoring. De combinatie van ligatie van de femorale slagader en IP-toediening van L-NAME kan op betrouwbare wijze hindlimb gangreen induceren bij FVB-muizen11. Dezelfde behandeling resulteert …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Z-J L en OC V van de National Institutes of Health [R01HL149452 en VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. We bedanken ook de Microscopie en Imaging Facility van het Miami Project to Cure Paralysis aan de University of Miami School of Medicine voor het bieden van toegang tot hun beeldanalyse- en verwerkingssoftware.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
