3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成
Summary
本論文では、I/Rの発達と治療をよりよく理解するために、脊髄カスタマイズフックを用いた3日間のひよこ胚における虚血再灌流(I/R)モデリングについて述べている。このモデルは、シンプルで迅速で、安価です。
Abstract
心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患などの虚血および再灌流(I/R)障害は、病気や死亡の主要な原因の一部です。イン ビトロ および インビボ モデルの多くは、現在、疾患または損傷した組織におけるI/Rメカニズムを研究するために利用可能です。しかし、現在までに 、ovo I/Rモデルには報告されておらず、I/Rメカニズムのより良い理解と薬物スクリーニングの迅速化を可能にする。この論文では、3日間のひよこ胚に脊髄をカスタマイズしたフックを用いてI/Rの発達と治療メカニズムを理解するI/Rモデリングについて説明する。このモデルは、DNA、RNA、およびタンパク質レベルの異常を調査するために使用できます。この方法は、簡単で、迅速で、安価です。現在のモデルは、独立して、または既存 のin vitro および in vivo I/Rモデルと組み合わせて使用することができます。
Introduction
虚血再灌流組織損傷は、心臓発作、虚血性脳卒中、外傷、および末梢血管疾患を含む多くの病理に関連している1、2、3、4,5。これは主に、疾患の進行に関する包括的な理解の欠如と効果的な研究モデルの欠如によるものです。虚血性損傷は、組織の特定の領域への血液供給が遮断されたときに起こる。その結果、虚血性組織は最終的に壊死するが、速度は組織によって異なる。したがって、血液供給を回復することは、損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。しかし、再灌流は虚血単独で6,7,8よりも多くの組織損傷を引き起こすことが観察されている。したがって、効果的な治療介入を開発するためには、虚血再灌流の分子および細胞機構を理解することが必要である。現在、I/R傷害に対する有効な治療法は知られていない。この格差により、in vitroからin vivoモデルに至るまで、既存の問題9,10,11,12,13に対処するための新しい実験モデルが作成されました。
ひよこ胚(ガルス・ガルス・ドメスティックス)は、アクセスの容易さ、倫理的受容性、比較的大きなサイズ(他の胚と比較して)、低コスト、および急速な成長のために研究に広く使用されています14。72時間の発達でひよこ胚を使用して、脊髄の助けを借りて右ビテリン動脈を閉塞して放出することで、ovo I/Rの中に胚を作り出しました。フックI/R虚血再灌流モデルと命名しました(図1)。本研究で利用されたモデルは、I/R損傷15,16,17に頻繁に関連する酸化および炎症経路を含むすべての下流プロセスを正確にシミュレートすることができる。
Protocol
Eraのラクナウ医科大学と病院の制度的動物倫理委員会は、動物実験の管理と監督を目的とした委員会(CPCSEA)に従ってこれらの実験を行うための正式な承認は必要ないという書面による免除を発行しました。しかし、胚性苦痛の可能性を最小限に抑えるために、標準的な操作手順に従った。 1. バッファ調製(表1) リンガーのソリューションを準備する …
Representative Results
ドップラー血流イメージング技術は、当社のモデルの有効性を評価するために使用されました。つまり、コントロールグループのデータと RVA グループのデータを比較して、作成の成功を判断しました。 図4Aは 、制御動物に関連する代表的なフラックスを示し、 図4B はRVAから得られた結果を示している。数値 1 から 8 は、I/R フェーズに関連付け?…
Discussion
虚血再灌流研究の目的は、細胞死を予防し、回復を促進する治療戦略を作成することです29,30.I/R研究における現在の制約を克服するために、我々は信頼性の高い、再生可能なI/Rモデルを作り出すためにフックI/Rのひよこ胚モデルを設計した。私たちの知る限りでは、私たちの知る限りでは、ストレス信号(酸化ストレスや炎症ストレスなど)を研究す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ビデオ撮影と編集中の彼の批判的なインプットに対するハリ・シャンカール、ナレーションのためのバケル・フセイン氏、ビデオ編集のためのアスガル・リズヴィ氏、ビデオ撮影のためのモハマド・ハイダー氏、実験中の支援のためのモハマド・デンマーク・シディキ氏に感謝したいと思います。
Materials
| (-80°C) freezer | Haier, China | – | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | – | – | |
| Egg rack | – | – | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | – | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | – | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
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Cite This Article
Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash, R., Siddiqui, A. J., Khan, M. A., Raza, S. S. Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo. J. Vis. Exp. (180), e63288, doi:10.3791/63288 (2022).