Geração de Modelo de Isquemia-Reperfusão de Gancho usando um embrião de pintinho em desenvolvimento de três dias

Summary

Este artigo descreve a modelagem isquemia-reperfusão (I/R) em um embrião de 3 dias usando um gancho personalizado de agulha espinhal para entender melhor o desenvolvimento e o tratamento da I/R. Este modelo é simples, rápido e barato.

Abstract

Distúrbios de isquemia e reperfusão (I/R), como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica, são algumas das principais causas de doença e morte. Muitos modelos in vitro e in vivo estão atualmente disponíveis para estudar o mecanismo de I/R em doenças ou tecidos danificados. No entanto, até o momento, nenhum modelo de I/R de ovo foi relatado, o que permitiria uma melhor compreensão dos mecanismos de I/R e uma triagem mais rápida de medicamentos. Este artigo descreve a modelagem de I/R usando um gancho personalizado de agulha espinhal em um embrião de 3 dias para entender os mecanismos de desenvolvimento e tratamento de I/R. Nosso modelo pode ser usado para investigar anomalias nos níveis de DNA, RNA e proteína. Este método é simples, rápido e barato. O modelo atual pode ser usado de forma independente ou em conjunto com os modelos in vitro e in vivo I/R existentes.

Introduction

A lesão tecidual isquemia-reperfusão tem sido associada a uma série de patologias, incluindo ataques cardíacos, acidente vascular cerebral isquêmico, trauma e doença vascular periférica1,2,3,4,5. Isso se deve principalmente à falta de uma compreensão abrangente da progressão da doença e à falta de um modelo de pesquisa eficaz. A lesão isquêmica ocorre quando o suprimento de sangue para uma área específica do tecido é cortado. Como resultado, o tecido isquêmico eventualmente necrosa, embora a taxa varie dependendo do tecido. Assim, restaurar o suprimento de sangue pode ajudar a mitigar os danos. No entanto, tem sido observado, em alguns casos, que a reperfusão causa mais danos teciduais do que a isquemia sozinha faz ^6,7,8. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da isquemia-reperfusão é necessária para desenvolver uma intervenção terapêutica eficaz. Atualmente, não se sabe nenhum tratamento eficaz para lesões de I/R. Essa disparidade levou à criação de novos modelos experimentais, que vão desde modelos in vitro até in vivo, para resolver o problema existente9,10,11,12,13.

Os embriões de filhotes (Gallus gallus domesticus) são amplamente utilizados em pesquisas devido à sua facilidade de acesso, aceitabilidade ética, tamanho relativamente grande (em comparação com outros embriões), baixo custo e rápido ^{crescimento14}. Utilizamos um embrião de pintinho a 72 h de desenvolvimento para criar um em ovo I/R octurando e liberando a artéria vitelline direita com a ajuda de uma agulha espinhal. Nós o chamamos de modelo de isperfusão de isquemia de Gancho-I/R (Figura 1). O modelo utilizado neste estudo é capaz de simular com precisão todos os processos a jusante, incluindo vias oxidativas e inflamatórias, frequentemente associadas a danos de I/R15,16,17.

Protocol

O Comitê de Ética Animal Institucional da Era’s Lucknow Medical College and Hospital emitiu uma renúncia por escrito afirmando que nenhuma aprovação formal foi necessária para realizar esses experimentos de acordo com o Comitê para fins de controle e supervisão de experimentos em animais (CPCSEA). No entanto, foram seguidos procedimentos operacionais padrão para minimizar qualquer potencial de sofrimento embrionário. 1. Preparação do buffer (Tabela 1) Pre…

Representative Results

A técnica do Doppler Blood Flow Imaging foi utilizada para avaliar a eficácia do nosso modelo. Em suma, comparamos os dados do grupo controle com os dados do grupo RVA para determinar o sucesso de nossa criação. A Figura 4A retrata um fluxo típico associado ao animal de controle, enquanto a Figura 4B retrata os resultados obtidos de um RVA. O 1-8 numérico representa os diversos eventos associados às fases de I/R. Resumindo, o 1-3 numérico corresponde à …

Discussion

O objetivo da pesquisa isquemia-reperfusão é criar estratégias terapêuticas que previnem a morte celular e promovam a recuperação ^29,30. Para superar as restrições atuais na pesquisa de I/R, projetamos um modelo de embrião de pintinhos Hook I/R para produzir um modelo de I/R confiável e reprodutível. Para nosso conhecimento, o nosso é o primeiro modelo de I/R já criado em um embrião de 3 dias para experimentos de I/R de rotina, além de estudar sina…

Materials

(-80°C) freezer	Haier, China	–
1.5mL Centrifuge tube	TARSONS, India	500010X
100mm Petri dish (sterile)	Tarsons, India	460050
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm)	Ramsons, India	13990
1mL Syringe	DISPO VAN	–
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm)	DISPO VAN, india	30722D
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity	Gentek, India	GL-100
37°C laboratory incubator	SCIENCE TECH, India	CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA)	Sigma Aldrich, USA	M9281
3mL Pasture Pipette	TARSONS, India	940050
50mL Beaker	TARSONS, India	–
5mL Syringe	DISPO VAN, India	IP53
70% ethanol	Merck Millipore, United States	64-17-5
Adhesive tape/Cello tape	Sunrise, India	–
Ambra1 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG	Cell Signaling Technology, USA	7076S
Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories, USA	711-035-152
Atg7	R&D Systems, USA	MAB6608
Atg7 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00893766_m1
Autoclave Bag	Tarsons, India	550022
Autoclave Machine	Local made, Lucknow, India	–
Beclin-1	Proteintech, USA	66665-1-Ig
Beta Actin	ImmunoTag, USA	ITT07018
Bovine Serum Albumin	Himedia, Mumbai, India	TC194
Calcium Chloride	Himedia, Mumbai, India	GRM534
Catalase	ImmunoTag, USA	ITT5155
Cleaning wipes	Kimberly-Clark, India	370080
Cleaved Caspase3	ImmunoTag, USA	ITT07022
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate	Himedia, Mumbai, India	GRM39611
Doppler blood flowmeter	Moors instrument, United Kingdom	moorVMS-LDF1
Egg rack	–	–
Egg rack	–	–
GAPDH	ImmunoTag, USA	M1000110
GAPDH primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs02758991_g1
Glycine	Himedia, Mumbai, India	MB013
Kidney tray	HOSPITO	–
LC3A/B	Cell Signaling Technology, USA	4108S
Methanol	Rankem laboratories, Mumbai, India	M0252
Micromanipulator	Narishige, Japan	M-152
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma Aldrich, USA	A7250
Naringenin	Sigma Aldrich, USA	67604-48-2
NF-kβ	Thermo Fisher Scientific, USA	51-0500
NLRP3	ImmunoTag, USA	ITT07438
Nose plier	Local made, Lucknow, India	–
Ocular forceps	Stoelting, Germany	52106-40
Ocular iris	Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India	Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP marker pen	Camlin, India	–
ORP-150	ImmunoTag, USA	ITT08329
Pointed sharp edge scissor	Stoelting, Germany	52132-11
Potassium Chloride	Himedia, Mumbai, India	MB043
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Himedia, Mumbai, India	MB050
Protease Inhibitor	Abcam, United States	Ab65621
SOD-1	ImmunoTag, USA	ITT4364
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Mumbai, India	27605
Sodium dodecyl sulphate	Himedia, Mumbai, India	GRM886
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm)	Ramson, India	GS-2029
Stereo Zoom surgical microscope	Olympus, Japan	SZ2-STU3
Syringe discarder	BIOHAZARD	882210
Toothed forceps	Stoelting, Germany	52102-30
Tris Base	G Biosciences, United States	RC1217
Tris Hydrochloric Acid	Himedia, Mumbai, India	MB030
Tween 20	G Biosciences, United States	RC1227
White Leghorn Chicken 0-day eggs	–	–
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK	MP Biomedicals, LLC, USA	FK009