포토스타틴을 이용한 살아있는 이식 전 마우스 배아에서 미세소관 세포골격의 시공간적 세포골격 조작
Summary
기본 및 응용 연구에 널리 사용되는 전형적인 미세 소관 억제제는 세포에 광범위한 영향을 미칩니다. 최근에, 포토스타틴은 미세소관의 순간적, 가역적, 공간적으로 정밀하게 조작할 수 있는 광전환 가능한 미세소관 억제제의 부류로 부상하였다. 이 단계별 프로토콜은 3D 라이브 이식 전 마우스 배아에서 포토스타틴의 적용을 자세히 설명합니다.
Abstract
미세 소관 세포 골격은 세포의 틀을 형성하며 세포 내 수송, 세포 분열 및 신호 전달의 기본입니다. 예를 들어, 노코다졸을 사용하는 유비쿼터스 미세 소관 네트워크의 전통적인 약리학적 파괴는 모든 세포에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 가역적으로 광전환가능한 미세소관 억제제는 약물 효과가 시공간적으로 조절된 방식으로 구현될 수 있게 함으로써 한계를 극복할 수 있는 잠재력을 갖는다. 이러한 약물 계열 중 하나는 아조 벤젠 기반 포토스타틴 (PSTs)입니다. 이들 화합물은 어두운 조건에서 비활성이며, 자외선으로 조명될 때, 이들은 β-튜불린의 콜히친-결합 부위에 결합하고 미세소관 중합 및 동적 턴오버를 차단한다. 여기서, 3차원(3D) 생이식 전 마우스 배아에 PSTs의 적용은 세포하 수준에서 미세소관 네트워크를 교란시키는 것으로 개시된다. 이 프로토콜은 실험 설정에 대한 지침뿐만 아니라 라이브 셀 공초점 현미경을 사용하는 PST에 대한 광 활성화 및 비활성화 매개 변수를 제공합니다. 이것은 재현성을 보장하고 다른 사람들이이 절차를 연구 질문에 적용 할 수있게합니다. PST와 같은 혁신적인 광 스위치는 동적 세포 내 미세 소관 네트워크에 대한 이해를 높이고 실시간으로 세포 골격을 비 침습적으로 조작하는 강력한 도구로 진화 할 수 있습니다. 또한, PST는 오가노이드, 블라스토이드 또는 다른 종의 배아와 같은 다른 3D 구조에서 유용하다는 것을 입증 할 수 있습니다.
Introduction
미세소관 구조는 다양한 기능(1,2)을 지원하기 위해 다양한 세포 유형에 따라 크게 다릅니다. 성장과 수축의 역동적 인 특성은 세포 외 및 세포 내 단서에 신속하게 적응하고 끊임없이 변화하는 세포의 요구에 대응할 수있게합니다. 따라서, 그것은 세포 정체성에서 중요한 역할을하는 “형태 학적 지문”으로 간주 될 수 있습니다.
소분자 억제제를 이용한 미세소관 세포골격의 약리학적 표적화는 발달생물학, 줄기세포생물학, 암생물학 및 신경생물학 3,4,5,6,7에서 많은 근본적인 발견을 가져왔다. 이 접근법은 필수 불가결하지만 독성 및 오프 타겟 효과와 같은 다양한 한계를 제시합니다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 미세소관 표적화 제제 중 하나인 노코다졸은 강력한 미세소관-탈중합 약물(8)이다. 그러나, 노코다졸과 같은 소분자 억제제는 적용 시부터 활성이며, 많은 중요한 세포 기능에 미세소관 세포골격의 본질적인 성질을 고려할 때, 미세소관의 글로벌 탈중합은 오프 타겟 효과를 생성할 수 있으며, 이는 많은 응용에 부적합할 수 있다. 또한, 노코다졸 처리는 샘플이 약물로부터 세척되지 않는 한 돌이킬 수 없으며, 따라서 지속적인 라이브 이미징을 방지하고, 따라서 개별 미세소관 필라멘트의 정확한 추적을 방지한다.
광활성화 화합물의 개발은 광미적 분자의 생성과 함께 시작되었으며, 미세소관 성장 억제의 효과를 정밀하고 시공간적으로 제어되는 방식으로 표적화하고 모니터링하는 새로운 시대를 예고했다. 가역적으로 광전환 가능한 약물의 한 군인 포토스타틴(PSTs)은 콤브레타스타틴 A-4의 스틸벤 성분을 아조벤젠9로 대체하여 개발되었다. PST는 자외선으로 조명될 때까지 비활성이며, 이에 의해 비활성 트랜스-구성은 가역적 이성체화에 의해 활성 시스-구성으로 변환 된다. Cis-PST는 β-튜불린의 콜히친 결합 부위에 결합하여 미세소관 중합을 억제하고, β-튜불린과의 계면을 차단하고, 미세소관 성장(10)에 필요한 이량체화를 방지한다. PST의 코호트 중에서, PST-1P는 가장 높은 효능을 가지며, 완전히 수용성이며, 조명 후 생체 활성의 빠른 발병을 보여주기 때문에 납 화합물로 부상했다.
PST의 가장 효과적인 트랜스– 시스-이성체화는 360-420 nm 사이의 파장에서 발생하며, 이는 PST 활성화를 위한 이중 옵션을 가능하게 한다. 전형적인 공초점 현미경 상의 405nm 레이저 라인은 미세소관 성장 억제의 최적의 공간 표적화를 위해 투여될 수 있다. 405nm 레이저 조명을 통해 PST 활성화의 위치와 타이밍을 정확히 파악할 수 있는 기능은 정밀한 시간 및 공간 제어를 용이하게 하여 초 미만의 응답 시간(9) 내에 세포 이하 수준에서 미세소관 역학의 붕괴를 허용한다. 대안으로, 저렴한 LED UV 광은 전체 유기체 조명이 미세 소관 구조의 유기체 전체 파괴를 유도하도록 허용합니다. 이것은 공간 타겟팅보다는 정확한 시간 억제의 발병이 목표인 연구자들에게 비용 효율적인 대안이 될 수 있습니다. PST의 또 다른 특징은 510-540 nm 범위9에서 파장의 녹색 빛을 적용하여 주문형 불활성화입니다. 이는 PST 매개 성장 억제 전, 도중, 및 후에 미세소관 필라멘트의 추적을 가능하게 한다.
PST는 여전히 비교적 최근의 설계이지만, 아메보이드(12)에서의 세포 이동의 새로운 메카니즘 조사, 신생아 마우스(13)의 뇌로부터 분리된 뉴런, 초파리 멜라노가스터(14)에서의 날개 상피 발달 등을 포함하여 다양한 연구 분야(11)에 걸친 수많은 시험관내 응용에 사용되어 왔다. . 다른 빛 반응성 약물은 세포 기능의 표적 파괴에 유용한 도구임이 입증되었습니다. 예를 들어, 블레비스타틴의 유사체인 아지도블레비스타틴이 조명15,16 하에서 향상된 미오신 억제를 위해 사용되었다. 이것은 시공간 적으로 조절 된 세포 기능 억제 능력 때문에 새로운 발견의 잠재력을 강조합니다.
살아있는 3D 유기체는 생리적 조건 하에서 전체 동물, 단일 세포 또는 세포 이하 수준에서 미세 소관 역학을 조작하는 탁월하면서도 섬세한 시스템을 제공합니다. 특히, 이식 전 마우스 배아는 유기체(17) 내의 세포간 관계뿐만 아니라 세포의 내부 작용에 대한 탁월한 통찰력을 제공한다. PSTs의 활성화 및 비활성화의 시간적 및 공간적으로 표적화된 연속적인 사이클은 이식 전 마우스 배아(16)에서 비중심성 미세소관-조직화 중심으로서 세포간 사이토카인증 구조인 상간 브릿지의 특성화에 기여하였다. 유사한 실험 셋업은 배반포 형성 18을 허용하기 위해 마우스 배아의 밀봉에서 성장하는 미세 소관의 관여를 입증하였다18. 또한, PSTs는 또한 뒷뇌19에서 세포의 서브세트에서 미세 소관 성장을 억제함으로써 신경 세포 이동을 조사하기 위해 전체 제브라 피쉬 배아에 사용되었다.
이 프로토콜은 이식 전 마우스 배아에서 PST-1P의 실험 설정 및 사용을 설명합니다. 여기에 제시된 지침은 또한 염색체 분리 및 세포 분열 연구, 세포 내화물의 밀매, 세포 형태 형성 및 이동과 같은 광범위한 목표에 대한 PST의 적용을 안내 할 수 있습니다. 또한, 이러한 연구는 오가노이드 시스템, 블라스토이드 및 Caenorhabditis elegans 및 Xenopus laevis와 같은 다른 배아 모델에서 PST의 구현을 돕고 잠재적으로 시험관 내 수정 기술에 대한 PST의 사용을 확대 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세 소관 네트워크는 세포의 근본적인 내부 작동에 필수적입니다. 결과적으로, 이것은 살아있는 유기체에서 미세 소관 역학을 조작하는 데 어려움을 겪는데, 네트워크에 대한 교란은 세포 기능의 모든 측면에 광범위한 영향을 미치는 경향이 있기 때문입니다. 광전환 가능한 미세소관-표적화 화합물의 출현은 미세소관 성장 억제의 유도 및 역전에 대한 우수한 제어와 함께 세포 골격을 아세포 수…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Oliver Thorn-Seshold 박사와 Li Gao 박사에게 포토스타틴과 원고 준비에 대한 조언, 촬영 지원을위한 Monash Production 및 현미경 지원을위한 Monash Micro Imaging 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 National Health and Medical Research Council (NHMRC) 프로젝트 보조금 APP2002507을 J.Z.에 지원하고 캐나다 고급 연구 연구소 (CIFAR) Azrieli 장학금을 J.Z.에 지원했습니다. Australian Regenerative Medicine Institute는 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
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