Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas
Summary
Inibidores típicos de microtúbulos, amplamente utilizados em pesquisas básicas e aplicadas, têm efeitos de longo alcance nas células. Recentemente, as fotostatinas surgiram como uma classe de inibidores de microtúbulos fotossentaráveis, capazes de manipulação instantânea, reversível e espacialmente precisa de microtúbulos. Este protocolo passo a passo detalha a aplicação de fotostatinas em um embrião de rato de pré-implantação 3D vivo.
Abstract
O citoesqueleto microtúbulo forma a estrutura de uma célula e é fundamental para o transporte intracelular, divisão celular e transdução de sinais. A ruptura farmacológica tradicional da onipresente rede de microtúbulos usando, por exemplo, nocodazol pode ter consequências devastadoras para qualquer célula. Inibidores de microtúbulos reversivelmente fotossceráveis têm o potencial de superar as limitações, permitindo que os efeitos medicamentosos sejam implementados de forma espacialmente controlada. Uma dessas famílias de drogas é a fotostatina baseada em azobenzeno (PSTs). Esses compostos são inativos em condições escuras, e após a iluminação com luz UV, eles se ligam ao local de ligação colchicina de β-tubulina e bloqueiam a polimerização de microtúbulos e a rotatividade dinâmica. Aqui, a aplicação de PSTs no embrião de rato de pré-implantação ao vivo 3D (3D) é definida para interromper a rede de microtúbulos em um nível subcelular. Este protocolo fornece instruções para a configuração experimental, bem como parâmetros de ativação e desativação de luz para PSTs usando microscopia confocal de células vivas. Isso garante a reprodutibilidade e permite que outras pessoas apliquem esse procedimento às suas questões de pesquisa. Fotossensíveis inovadores como os PSTs podem evoluir como ferramentas poderosas para avançar na compreensão da rede dinâmica de microtúbulos intracelulares e manipular não invasivamente o citoesqueleto em tempo real. Além disso, os PSTs podem ser úteis em outras estruturas 3D, como organoides, blastóides ou embriões de outras espécies.
Introduction
A arquitetura de microtúbulos varia amplamente entre diferentes tipos de células para suportar diversas funções 1,2. Sua natureza dinâmica de crescimento e encolhimento permite uma rápida adaptação a pistas extra e intracelulares e responder às necessidades em constante mudança de uma célula. Assim, pode ser considerada como a “impressão digital morfológica” desempenhando um papel fundamental na identidade celular.
O direcionamento farmacológico do citoesqueleto microtúbulo usando inibidores de pequenas moléculas levou a uma infinidade de descobertas fundamentais na biologia do desenvolvimento, biologia de células-tronco, biologia do câncer e neurobiologia 3,4,5,6,7. Essa abordagem, embora indispensável, apresenta várias limitações, como toxicidade e efeitos fora do alvo. Por exemplo, um dos agentes de microtúbula mais utilizados, nocodazole, é uma poderosa droga despolimerizadora de microtúbulos8. No entanto, inibidores de pequenas moléculas como o nocodazol são ativos desde o momento da aplicação e, dada a natureza essencial do citoesqueleto microtúbulo para muitas funções celulares críticas, a despolimerização global de microtúbulos pode produzir efeitos fora do alvo, que podem ser inadequados para muitas aplicações. Além disso, o tratamento do nocodazol é irreversível, a menos que as amostras sejam lavadas livre da droga, prevenindo imagens vivas contínuas e, portanto, o rastreamento preciso de filamentos microtúbulos individuais.
O desenvolvimento de compostos ativados pela luz começou com a criação de moléculas fotouncaged e anunciou uma nova era na segmentação e monitoramento dos efeitos da inibição do crescimento de microtúbulos de forma precisa e espacialmente controlada. Uma família de drogas reversivelmente fotowitchable, fotostatinas (PSTs), foram desenvolvidas substituindo o componente de stilbene da combretastatina A-4 por azobenzeno9. Os PSTs estão inativos até a iluminação com luz UV, pela qual a configuração trans inativa se converte na configuração cis ativa por isomerização reversível. Os Cis-PSTs inibem a polimerização de microtúbulos ligando-se ao local de ligação colchicina de β-tubulina, bloqueando sua interface com β-tubulina e prevenindo a dimerização necessária para o crescimento de microtúbulos10. Entre uma coorte de PSTs, pst-1P emergiu como um composto de chumbo, pois tem a maior potência, é totalmente solúvel em água, e mostra um rápido início de bioatividade após a iluminação.
A trans-isomerização mais eficaz de PSTs ocorre em comprimentos de onda entre 360-420 nm, o que permite duas opções para ativação de PST. Uma linha laser de 405 nm em um microscópio confocal típico pode ser administrada para o direcionamento espacial ideal da inibição do crescimento de microtúbulos. A capacidade de identificar a localização e o tempo da ativação do PST através da iluminação laser de 405 nm facilita o controle temporal e espacial preciso, permitindo a interrupção da dinâmica dos microtúbulos em um nível subcelular, dentro do vezes de resposta sub-segundo9. Alternativamente, uma luz LED UV acessível permite que a iluminação do organismo inteiro induza a interrupção em todo o organismo da arquitetura do microtúbulo. Esta pode ser uma alternativa econômica para pesquisadores para os quais o início precisamente cronometrado da inibição, em vez de direcionamento espacial, é o objetivo. Outra característica dos PSTs é sua inativação sob demanda, aplicando luz verde de um comprimento de onda na faixa de 510-540 nm9. Isso permite o rastreamento de filamentos microtúbulos antes, durante e depois da inibição de crescimento mediada pelo PST.
Os PSTs, embora ainda um projeto relativamente recente, têm sido usados em inúmeras aplicações in vitro em diversos campos de pesquisa11, incluindo a investigação de novos mecanismos de migração celular em ameebóides12, em neurônios isolados do cérebro do camundongo recém-nascido13, e desenvolvimento de epitélio de asa em Drosophila melanogaster14 . Outras drogas leves reativas provaram ser ferramentas valiosas na interrupção direcionada da função celular. Por exemplo, um análogo de blebbistatina, azidoblebbistatin, foi usado para a inibição aprimorada da mosina sob iluminação15,16. Isso destaca o potencial para novas descobertas devido à capacidade de inibição espacialmente controlada da função celular.
Organismos 3D vivos apresentam sistemas soberbos e ainda mais delicados para manipular a dinâmica dos microtúbulos em um nível animal inteiro, unicelular ou subcelular em condições fisiológicas. Em particular, o embrião do rato de pré-implantação oferece uma visão excepcional do funcionamento interno da célula, bem como das relações intercelulares dentro de um organismo17. Ciclos consecutivos de ativação e desativação de PSTs contribuíram para a caracterização da ponte interfase, uma estrutura pós-citocinética entre as células, como um centro-organizador de microtúbulos não centrosômicos no embrião de camundongos pré-implantação16. Uma configuração experimental semelhante demonstrou o envolvimento de microtúbulos crescentes na vedação do embrião do rato para permitir a formação de blastocisto18. Além disso, os PSTs também foram usados em embriões inteiros de zebrafish para investigar a migração de células neuronais inibindo o crescimento de microtúbulos em um subconjunto de células no cérebro traseiro19.
Este protocolo descreve a configuração experimental e o uso de PST-1P no embrião do rato de pré-implantação. As instruções aqui apresentadas também podem orientar a aplicação de PSTs para uma ampla gama de objetivos, como o estudo da segregação de cromossomo e divisão celular, tráfico de carga intracelular e morfogênese celular e migração. Além disso, tais estudos auxiliarão a implementação de PSTs em sistemas organoides, blastóides e outros modelos de embriões, como Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, bem como potencialmente expandirão o uso de PSTs para tecnologias de fertilização in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
A rede de microtúbulos é parte integrante do funcionamento interno fundamental de uma célula. Consequentemente, isso apresenta desafios na manipulação da dinâmica dos microtúbulos em organismos vivos, pois qualquer perturbação à rede tende a ter consequências generalizadas para todos os aspectos da função celular. O surgimento de compostos de microtúbulos fototravavel apresenta uma maneira de manipular precisamente o citoesqueleto em um nível subcelular, com controle superior para a indução e reversão d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao por nos fornecerem fotostatinas e conselhos sobre preparação de manuscritos, Monash Production para suporte de filmagem e Monash Micro Imaging para suporte a microscopia.
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do National Health and Medical Research Council (NHMRC) para a J.Z. e o Instituto Canadense de Pesquisa Avançada (CIFAR) Azrieli Scholarship para J.Z. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano.
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
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