Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

Summary

Typische Mikrotubuli-Inhibitoren, die in der Grundlagen- und angewandten Forschung weit verbreitet sind, haben weitreichende Auswirkungen auf Zellen. In jüngster Zeit haben sich Photostatine zu einer Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, mikrotubuli augenblicklich, reversibel, räumlich-zeitlich präzise zu manipulieren. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Anwendung von Photostatinen in einem 3D-lebenden Präimplantations-Mausembryo.

Abstract

Das Mikrotubuli-Zytoskelett bildet das Gerüst einer Zelle und ist grundlegend für den intrazellulären Transport, die Zellteilung und die Signaltransduktion. Traditionelle pharmakologische Störungen des allgegenwärtigen Mikrotubuli-Netzwerks, die beispielsweise Nocodazol verwenden, können verheerende Folgen für jede Zelle haben. Reversibel photoschaltbare Mikrotubuli-Inhibitoren haben das Potenzial, die Einschränkungen zu überwinden, indem sie die Umsetzung von Arzneimittelwirkungen in einer räumlich-zeitlich kontrollierten Weise ermöglichen. Eine solche Familie von Medikamenten sind die Azobenol-basierten Photostatine (PSTs). Diese Verbindungen sind unter dunklen Bedingungen inaktiv und binden bei Beleuchtung mit UV-Licht an die Colchicin-Bindungsstelle des β-Tubulins und blockieren die Mikrotubulipolymerisation und den dynamischen Umsatz. Hier soll die Anwendung von PSTs im 3-dimensionalen (3D) lebenden Präimplantations-Mausembryo das Mikrotubuli-Netzwerk auf subzellulärer Ebene stören. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Versuchsaufbau sowie Lichtaktivierungs- und Deaktivierungsparameter für PSTs mit konfokaler Lebendzellmikroskopie. Dies gewährleistet die Reproduzierbarkeit und ermöglicht es anderen, dieses Verfahren auf ihre Forschungsfragen anzuwenden. Innovative Fotoschalter wie PSTs können sich zu leistungsstarken Werkzeugen entwickeln, um das Verständnis des dynamischen intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks voranzutreiben und das Zytoskelett in Echtzeit nicht-invasiv zu manipulieren. Darüber hinaus können sich PSTs in anderen 3D-Strukturen wie Organoiden, Blastoiden oder Embryonen anderer Spezies als nützlich erweisen.

Introduction

Die Mikrotubuli-Architektur variiert stark zwischen verschiedenen Zelltypen, um verschiedene Funktionen zu unterstützen ^1,2. Seine dynamische Natur des Wachstums und der Schrumpfung ermöglicht eine schnelle Anpassung an extra- und intrazelluläre Hinweise und die Reaktion auf die sich ständig ändernden Bedürfnisse einer Zelle. Daher kann es als der “morphologische Fingerabdruck” betrachtet werden, der eine Schlüsselrolle bei der zellulären Identität spielt.

Das pharmakologische Targeting des Mikrotubuli-Zytoskeletts unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren hat zu einer Fülle grundlegender Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie, Stammzellbiologie, Krebsbiologie und Neurobiologie^geführt 3,4,5,6,7. Dieser Ansatz ist zwar unverzichtbar, weist jedoch verschiedene Einschränkungen wie Toxizität und Off-Target-Effekte auf. Zum Beispiel ist eines der am weitesten verbreiteten Mikrotubuli-Targeting-Mittel, Nocodazol, ein starkes Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel⁸. Niedermolekulare Inhibitoren wie Nocodazol sind jedoch ab dem Zeitpunkt der Anwendung aktiv, und angesichts der essentiellen Natur des Mikrotubuli-Zytoskeletts für viele kritische zelluläre Funktionen kann die globale Depolymerisation von Mikrotubuli Off-Target-Effekte erzeugen, die für viele Anwendungen ungeeignet sein können. Darüber hinaus ist die Nocodazol-Behandlung irreversibel, es sei denn, die Proben werden frei von dem Arzneimittel gewaschen, wodurch eine kontinuierliche Live-Bildgebung und damit eine präzise Verfolgung einzelner Mikrotubuli-Filamente verhindert wird.

Die Entwicklung lichtaktivierter Verbindungen begann mit der Schaffung von photounkäfigförmigen Molekülen und hat eine neue Ära in der gezielten und überwachung der Auswirkungen der Wachstumshemmung von Mikrotubuli auf präzise und räumlich-zeitlich kontrollierte Weise eingeläutet. Eine Familie von reversibel photoschaltbaren Medikamenten, Photostatine (PSTs), wurde entwickelt, indem die Stilbenkomponente von Combretastatin A-4 durch Azobenzel 9 ersetzt^wurde. PSTs sind bis zur Beleuchtung mit UV-Licht inaktiv, wobei die inaktive Transkonfiguration durch reversible Isomerisierung in die aktive cis-Konfiguration umgewandelt wird. Cis-PSTs hemmen die Mikrotubulipolymerisation durch Bindung an die Colchicin-Bindungsstelle von β-Tubulin, blockieren seine Grenzfläche mit β-Tubulin und verhindern die für das Wachstum der Mikrotubuli erforderliche Dimerisierung¹⁰. Unter einer Kohorte von PSTs hat sich PST-1P als Bleiverbindung herauskristallisiert, da es die höchste Potenz hat, vollständig wasserlöslich ist und nach der Beleuchtung einen schnellen Beginn der Bioaktivität zeigt.

Die effektivste Trans– bis Cis-Isomerisierung von PSTs erfolgt bei Wellenlängen zwischen 360-420 nm, was zwei Optionen für die PST-Aktivierung ermöglicht. Eine 405-nm-Laserlinie auf einem typischen konfokalen Mikroskop kann für eine optimale räumliche Ausrichtung der Mikrotubuli-Wachstumshemmung verabreicht werden. Die Möglichkeit, den Ort und das Timing der PST-Aktivierung durch 405-nm-Laserbeleuchtung zu bestimmen, erleichtert eine präzise zeitliche und räumliche Kontrolle, die eine Störung der Mikrotubuli-Dynamik auf subzellulärer Ebene innerhalb von Subsekunden-Reaktionszeiten^{ermöglicht 9}. Alternativ ermöglicht ein erschwingliches LED-UV-Licht die Beleuchtung des gesamten Organismus, um eine organismusweite Störung der Mikrotubuli-Architektur zu induzieren. Dies kann eine kostengünstige Alternative für Forscher sein, für die der genau zeitlich abgestimmte Beginn der Hemmung und nicht das räumliche Targeting das Ziel ist. Ein weiteres Merkmal von PSTs ist ihre On-Demand-Inaktivierung durch Anlegen von grünem Licht einer Wellenlänge im Bereich von 510-540 nm⁹. Dies ermöglicht die Rückverfolgung von Mikrotubuli-Filamenten vor, während und nach der PST-vermittelten Wachstumshemmung.

PSTs, obwohl noch ein relativ neues Design, wurden in zahlreichen In-vitro-Anwendungen in verschiedenen Forschungsbereichen^{eingesetzt 11}, einschließlich der Untersuchung neuer Mechanismen der Zellmigration in Amöboiden¹², in Neuronen, die aus dem Gehirn der neugeborenen Maus^{isoliert wurden 13}, und der Flügelepithelentwicklung in Drosophila melanogaster¹⁴ . Andere lichtreaktive Medikamente haben sich als wertvolle Werkzeuge zur gezielten Störung der Zellfunktion erwiesen. Zum Beispiel wurde ein Analogon von Blebbistatin, Azidoblebbistatin, zur verstärkten Myosinhemmung unter Beleuchtung^15,16 verwendet. Dies unterstreicht das Potenzial für neue Entdeckungen aufgrund der Fähigkeit zur räumlich-zeitlich kontrollierten Hemmung der zellulären Funktion.

Lebende 3D-Organismen präsentieren hervorragende, aber empfindlichere Systeme, um die Dynamik von Mikrotubuli auf Ganztier-, Einzelzell- oder subzellulärer Ebene unter physiologischen Bedingungen zu manipulieren. Insbesondere der Präimplantationsmausembryo bietet einen außergewöhnlichen Einblick in das Innenleben der Zelle sowie in die interzellulären Beziehungen innerhalb eines Organismus¹⁷. Zeitlich und räumlich zielgerichtete aufeinanderfolgende Zyklen der Aktivierung und Deaktivierung von PSTs trugen zur Charakterisierung der Interphasenbrücke, einer postzytokinetischen Struktur zwischen Zellen, als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-organisierendes Zentrum im Präimplantationsmausembryo^{bei 16}. Ein ähnlicher Versuchsaufbau zeigte die Beteiligung wachsender Mikrotubuli an der Versiegelung des Mausembryos, um die Blastozystenbildung zu ermöglichen¹⁸. Darüber hinaus wurden PSTs auch in ganzen Zebrafischembryonen verwendet, um die neuronale Zellmigration zu untersuchen, indem das Wachstum von Mikrotubuli in einer Untergruppe von Zellen im Hinterhirn gehemmt^{wurde 19}.

Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Aufbau und die Verwendung von PST-1P im Präimplantations-Mausembryo. Die hier vorgestellten Anweisungen können auch die Anwendung von PSTs für eine breite Palette von Zielen wie die Untersuchung der Chromosomensegregation und Zellteilung, des Handels mit intrazellulärer Fracht sowie der Zellmorphogenese und -migration leiten. Darüber hinaus werden solche Studien die Implementierung von PSTs in Organoidsystemen, Blastoiden und anderen Embryomodellen wie Caenorhabditis elegans und Xenopus laevis unterstützen und möglicherweise die Verwendung von PSTs für In-vitro-Fertilisationstechnologien erweitern.

Protocol

Die Experimente wurden von der Monash Animal Ethics Committee unter der Tierethiknummer 19143 genehmigt. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung (Monash Animal Research Platform) unter strikten ethischen Richtlinien unter bestimmten pathogenfreien Tierstallbedingungen untergebracht. 1. Präimplantations-Maus-Embryo-Entnahme Superovulierte und paarende Mäuse wie zuvor beschrieben16,18, in Übereinstimmung mit…

Representative Results

In Übereinstimmung mit dem Protokoll wurden Präimplantations-Mausembryonen mit cRNA für EB3 mikroinjiziert, die mit rot fluoreszierenden dTomato (EB3-dTomato) markiert wurde. Dies ermöglicht die Visualisierung wachsender Mikrotubuli, da EB3 an polymerisierende Mikrotubuli plus ends24 bindet. Die Experimente wurden 3 Tage nach der Befruchtung (E3) durchgeführt, wenn der Mausembryo aus 16 Zellen besteht. Abhängig von der zu untersuchenden wissenschaftlichen Frageste…

Discussion

Das Mikrotubuli-Netzwerk ist integraler Bestandteil des grundlegenden Innenlebens einer Zelle. Folglich stellt dies eine Herausforderung bei der Manipulation der Mikrotubulidynamik in lebenden Organismen dar, da jede Störung des Netzwerks tendenziell weitreichende Folgen für alle Aspekte der zellulären Funktion hat. Das Aufkommen von photoschaltbaren Mikrotubuli-Targeting-Verbindungen stellt eine Möglichkeit dar, das Zytoskelett auf subzellulärer Ebene präzise zu manipulieren, mit überlegener Kontrolle für die In…

Materials

Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides – LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes – 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch – Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice – wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes – Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss