Spatiotemporal subcellulær manipulering av mikrotubulen Cytoskeleton i living preimplantasjon mus embryo ved hjelp av photostatiner

Summary

Typiske mikrotubulhemmere, som brukes mye i grunnleggende og anvendt forskning, har vidtrekkende effekter på celler. Nylig oppstod fotostatiner som en klasse av fotoswitchable mikrotubulehemmere, i stand til øyeblikkelig, reversibel, romlig presis manipulering av mikrotubuler. Denne trinnvise protokollen beskriver bruken av fotostatiner i et 3D live preimplantasjonsmusembryo.

Abstract

Mikrotubule cytoskeleton danner rammen av en celle og er grunnleggende for intracellulær transport, celledeling og signaltransduksjon. Tradisjonell farmakologisk forstyrrelse av det allestedsnærværende mikrotubule nettverket ved hjelp av for eksempel nokodazol kan ha ødeleggende konsekvenser for enhver celle. Reversibelt fotoswitchable mikrotubulehemmere har potensial til å overvinne begrensningene ved å gjøre det mulig å implementere legemiddeleffekter på en romlig kontrollert måte. En slik familie av narkotika er de azobenzenbaserte fotostatiner (PSTs). Disse forbindelsene er inaktive i mørke forhold, og ved belysning med UV-lys binder de seg til det kolchicinbindende stedet for β-tubulin og blokkerer mikrotubul polymerisering og dynamisk omsetning. Her er anvendelsen av PSTs i det 3-dimensjonale (3D) levende preimplantasjonsmusembryoet satt ut for å forstyrre mikrotubulenettverket på et subcellulært nivå. Denne protokollen gir instruksjoner for det eksperimentelle oppsettet, samt lysaktiverings- og deaktiveringsparametere for PST-er ved hjelp av live-celle confocal mikroskopi. Dette sikrer reproduserbarhet og gjør det mulig for andre å anvende denne prosedyren på sine forskningsspørsmål. Innovative fotoswitches som PSTs kan utvikle seg som kraftige verktøy for å fremme forståelsen av det dynamiske intracellulære mikrotubule nettverket og å ikke-invasivt manipulere cytoskjelettet i sanntid. Videre kan PSTs være nyttige i andre 3D-strukturer som organoider, blastoider eller embryoer av andre arter.

Introduction

Mikrotubularkitekturen varierer mye på tvers av forskjellige celletyper for å støtte forskjellige funksjoner ^1,2. Dens dynamiske natur av vekst og krymping gir rask tilpasning til ekstra- og intracellulære signaler og for å svare på de stadig skiftende behovene til en celle. Derfor kan det betraktes som det “morfologiske fingeravtrykket” som spiller en nøkkelrolle i cellulær identitet.

Farmakologisk målretting av mikrotubul cytoskeleton ved hjelp av små molekylhemmere har ført til en mengde grunnleggende funn innen utviklingsbiologi, stamcellebiologi, kreftbiologi og nevrobiologi ^3,4,5,6,7. Denne tilnærmingen, selv om den er uunnværlig, presenterer ulike begrensninger som toksisitet og off-target effekter. For eksempel er et av de mest brukte mikrotubule-målrettingsmidlene, nokodazol, et kraftig mikrotubule-depolymeriserende legemiddel⁸. Imidlertid er småmolekylhemmere som nokodazol aktive fra påføringstidspunktet, og gitt mikrotubulens essensielle cytoskjelett til mange kritiske cellulære funksjoner, kan global depolymerisering av mikrotubuler produsere off-target effekter, noe som kan være uegnet for mange applikasjoner. I tillegg er nokodazolbehandling irreversibel med mindre prøver vaskes fri for stoffet, forhindrer kontinuerlig levende avbildning og dermed presis sporing av individuelle mikrotubulfilamenter.

Utviklingen av lysaktiverte forbindelser begynte med opprettelsen av fotouncaged molekyler og har varslet en ny epoke i målretting og overvåking av effekten av mikrotubul veksthemming på en presis og romlig kontrollert måte. En familie av reversibelt fotowitchable stoffer, fotostatiner (PSTs), ble utviklet ved å erstatte stilbenekomponenten i combretastatin A-4 med azobenzene⁹. PST-er er inaktive til belysning med UV-lys, der den inaktive transkonfigurasjonen konverteres til den aktive cis-konfigurasjonen ved reversibel isomerisering. Cis-PSTs hemmer mikrotubul polymerisering ved å binde seg til kolchicinbindingsstedet til β-tubulin, blokkere grensesnittet med β-tubulin og forhindre dimerisering som kreves for mikrotubul vekst¹⁰. Blant en kohort av PSTs har PST-1P dukket opp som en blyforbindelse, da den har den høyeste styrken, er helt vannløselig og viser en rask utbrudd av bioaktivitet etter belysning.

Den mest effektive trans– til cis-isomerization av PSTs skjer ved bølgelengder mellom 360-420 nm, noe som muliggjør doble alternativer for PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på et typisk konfokalt mikroskop kan administreres for optimal romlig målretting av mikrotubul veksthemming. Evnen til å finne plasseringen og tidspunktet for PST-aktivering gjennom 405 nm laserbelysning letter presis tids- og romlig kontroll, noe som muliggjør forstyrrelse av mikrotubuldynamikk på et subcellulært nivå, innen under-sekund responstid⁹. Alternativt tillater et rimelig LED UV-lys hele organismebelysning for å indusere organismeomfattende forstyrrelse av mikrotubularkitekturen. Dette kan være et kostnadseffektivt alternativ for forskere som nettopp har tidsberegnet inhibering, i stedet for romlig målretting, er målet. En annen funksjon ved PSTs er deres on-demand inaktivering ved å bruke grønt lys av en bølgelengde i området 510-540 nm⁹. Dette muliggjør sporing av mikrotubulfilamenter før, under og etter PST-mediert veksthemming.

PSTs, mens fortsatt en relativt nylig design, har blitt brukt i mange in vitro applikasjoner på tvers av ulike forskningsfelt¹¹, inkludert å undersøke nye mekanismer for cellemigrasjon i amoeboider¹², i nevroner isolert fra hjernen til den nyfødte musen¹³, og wing epitel utvikling i Drosophila melanogaster¹⁴ . Andre lys-reaktive stoffer har vist seg å være verdifulle verktøy i målrettet forstyrrelse av cellulær funksjon. For eksempel ble en analog av blebbistatin, azidoblebbistatin, brukt til forbedret myosininhibering under belysning ^15,16. Dette fremhever potensialet for nye funn på grunn av evnen til romlig kontrollert hemming av cellulær funksjon.

Levende 3D-organismer presenterer suverene, men mer delikate systemer for å manipulere mikrotubuldynamikk på et helt dyr, encellet eller subcellulært nivå under fysiologiske forhold. Spesielt gir preimplantasjonsmusembryoen eksepsjonell innsikt i cellens indre arbeid samt intercellulære forhold i en organisme¹⁷. Tidsmessig og romlig målrettede påfølgende sykluser av aktivering og deaktivering av PSTs bidro til karakteriseringen av den interfasebroen, en post-cytokinetisk struktur mellom celler, som et ikke-sentrosomalt mikrotubule-organiseringssenter i preimplantasjonsmusembryo¹⁶. Et lignende eksperimentelt oppsett demonstrerte involvering av voksende mikrotubuler i forseglingen av museembryoet for å tillate blastocystformasjon¹⁸. Videre ble PSTs også brukt i hele sebrafiskembryoer for å undersøke nevronal cellemigrasjon ved å hemme mikrotubulvekst i en undergruppe av celler i hindbrain¹⁹.

Denne protokollen beskriver det eksperimentelle oppsettet og bruken av PST-1P i preimplantasjonsmusembryoet. Instruksjonene som presenteres her kan også veilede anvendelsen av PSTs for et bredt spekter av mål som å studere kromosomsegregering og celledeling, smugling av intracellulær last og cellemorfogenese og migrasjon. Videre vil slike studier hjelpe implementeringen av PSTs i organoidsystemer, blastoider og andre embryomodeller som Caenorhabditis elegans og Xenopus laevis, samt potensielt utvide bruken av PSTs for in vitro befruktningsteknologier.

Protocol

Eksperimenter ble godkjent av Monash Animal Ethics Committee under animalsk etikknummer 19143. Dyr ble plassert i spesifikke patogenfrie dyrehusforhold på dyreanlegget (Monash Animal Research Platform) i henhold til etiske retningslinjer. 1. Preimplantasjon mus embryo samling Superovulate og mate mus som beskrevet tidligere 16,18, i samsvar med institusjonelle dyreetiske retningslinjer.MERK: De mest bruk…

Representative Results

I tråd med protokollen ble preimplantasjonsmusembryoer mikroinjisert med cRNA for EB3, merket med rød fluorescerende dTomato (EB3-dTomato). Dette muliggjør visualisering av voksende mikrotubuler når EB3 binder seg til polymerisering av mikrotubul pluss ender24. Forsøkene ble utført 3 dager etter befruktning (E3) når museembryoet består av 16 celler. Ethvert annet utviklingsstadium førimplantasjon kan brukes, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som skal …

Discussion

Mikrotubulenettverket er integrert i de grunnleggende indre arbeidene til en celle. Følgelig gir dette utfordringer med å manipulere mikrotubuldynamikk i levende organismer, da enhver perturbasjon til nettverket har en tendens til å ha utbredte konsekvenser for alle aspekter av cellulær funksjon. Fremveksten av fotoswitchable mikrotubule-målretting forbindelser presenterer en måte å nøyaktig manipulere cytoskeleton på et subcellulært nivå, med overlegen kontroll for induksjon og reversering av mikrotubul vekst…

Materials

Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides – LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes – 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch – Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice – wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes – Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss