Manipulación subcelular espaciotemporal del citoesqueleto de microtúbulos en el embrión de ratón vivo preimplantacional utilizando fotostatinas
Summary
Los inhibidores típicos de los microtúbulos, utilizados ampliamente en la investigación básica y aplicada, tienen efectos de gran alcance en las células. Recientemente, las fotostatinas surgieron como una clase de inhibidores de microtúbulos fotoconmutables, capaces de manipular instantáneamente, reversible y espaciotemporalmente precisa de microtúbulos. Este protocolo paso a paso detalla la aplicación de fotostatinas en un embrión de ratón preimplantacional vivo en 3D.
Abstract
El citoesqueleto de microtúbulos forma el marco de una célula y es fundamental para el transporte intracelular, la división celular y la transducción de señales. La interrupción farmacológica tradicional de la red de microtúbulos ubicuos utilizando, por ejemplo, nocodazol puede tener consecuencias devastadoras para cualquier célula. Los inhibidores de microtúbulos fotoconmutables reversiblemente tienen el potencial de superar las limitaciones al permitir que los efectos de los medicamentos se implementen de una manera controlada espaciotemporalmente. Una de esas familias de medicamentos son las fotostatinas a base de azobenceno (PST). Estos compuestos son inactivos en condiciones de oscuridad, y al iluminarse con luz UV, se unen al sitio de unión a la colchicina de β-tubulina y bloquean la polimerización del microtúbulo y la rotación dinámica. Aquí, la aplicación de PST en el embrión de ratón preimplantacional vivo de 3 dimensiones (3D) se establece para interrumpir la red de microtúbulos a nivel subcelular. Este protocolo proporciona instrucciones para la configuración experimental, así como parámetros de activación y desactivación de la luz para PST que utilizan microscopía confocal de células vivas. Esto asegura la reproducibilidad y permite a otros aplicar este procedimiento a sus preguntas de investigación. Los fotointerruptores innovadores como los PST pueden evolucionar como herramientas poderosas para avanzar en la comprensión de la red dinámica de microtúbulos intracelulares y para manipular de forma no invasiva el citoesqueleto en tiempo real. Además, los PST pueden resultar útiles en otras estructuras 3D como organoides, blastoides o embriones de otras especies.
Introduction
La arquitectura de los microtúbulos varía ampliamente entre los diferentes tipos de células para admitir diversas funciones 1,2. Su naturaleza dinámica de crecimiento y contracción permite una rápida adaptación a las señales extra e intracelulares y responder a las necesidades siempre cambiantes de una célula. Por lo tanto, se puede considerar como la “huella morfológica” que juega un papel clave en la identidad celular.
La orientación farmacológica del citoesqueleto de microtúbulos utilizando inhibidores de moléculas pequeñas ha llevado a una gran cantidad de descubrimientos fundamentales en biología del desarrollo, biología de células madre, biología del cáncer y neurobiología 3,4,5,6,7. Este enfoque, si bien es indispensable, presenta varias limitaciones, como la toxicidad y los efectos fuera del objetivo. Por ejemplo, uno de los agentes dirigidos a los microtúbulos más utilizados, el nocodazol, es un potente fármaco despolimerizante de microtúbulos8. Sin embargo, los inhibidores de moléculas pequeñas como el nocodazol están activos desde el momento de la aplicación y, dada la naturaleza esencial del citoesqueleto de microtúbulos para muchas funciones celulares críticas, la despolimerización global de microtúbulos puede producir efectos fuera del objetivo, que pueden ser inadecuados para muchas aplicaciones. Además, el tratamiento con nocodazol es irreversible a menos que las muestras se laven libres del medicamento, lo que impide la obtención continua de imágenes en vivo y, por lo tanto, el seguimiento preciso de los filamentos de microtúbulos individuales.
El desarrollo de compuestos activados por la luz comenzó con la creación de moléculas fotouncatadas y ha anunciado una nueva era en la orientación y el monitoreo de los efectos de la inhibición del crecimiento de microtúbulos de una manera precisa y controlada espaciotemporalmente. Una familia de fármacos fotoconmutables reversiblemente, las fotostatinas (PST), se desarrollaron reemplazando el componente de estilbeno de la combretastatina A-4 con azobenceno9. Los PST están inactivos hasta la iluminación con luz UV, por lo que la transconfiguración inactiva se convierte en la configuración cis activa por isomerización reversible. Los Cis-PST inhiben la polimerización de microtúbulos al unirse al sitio de unión de colchicina de β-tubulina, bloqueando su interfaz con β-tubulina y previniendo la dimerización requerida para el crecimiento de microtúbulos10. Entre una cohorte de PST, PST-1P ha surgido como un compuesto de plomo, ya que tiene la mayor potencia, es totalmente soluble en agua y muestra un rápido inicio de bioactividad después de la iluminación.
La isomerización trans-a cis más efectiva de los PST ocurre en longitudes de onda entre 360-420 nm, lo que permite opciones duales para la activación de PST. Se puede administrar una línea láser de 405 nm en un microscopio confocal típico para una orientación espacial óptima de la inhibición del crecimiento de microtúbulos. La capacidad de identificar la ubicación y el momento de la activación de PST a través de la iluminación láser de 405 nm facilita el control temporal y espacial preciso, lo que permite la interrupción de la dinámica de los microtúbulos a nivel subcelular, dentro de los tiempos de respuesta de menos de un segundo9. Alternativamente, una luz UV LED asequible permite que la iluminación de todo el organismo induzca la interrupción de la arquitectura de los microtúbulos en todo el organismo. Esta puede ser una alternativa rentable para los investigadores para quienes el inicio de la inhibición en el momento preciso, en lugar de la orientación espacial, es el objetivo. Otra característica de los PST es su inactivación bajo demanda mediante la aplicación de luz verde de una longitud de onda en el rango de 510-540 nm9. Esto permite el rastreo de filamentos de microtúbulos antes, durante y después de la inhibición del crecimiento mediada por PST.
Los PST, aunque todavía son un diseño relativamente reciente, se han utilizado en numerosas aplicaciones in vitro en diversos campos de investigación11, incluida la investigación de nuevos mecanismos de migración celular en ameboides12, en neuronas aisladas del cerebro del ratón recién nacido13 y el desarrollo del epitelio del ala en Drosophila melanogaster14 . Otros medicamentos reactivos a la luz han demostrado ser herramientas valiosas en la interrupción dirigida de la función celular. Por ejemplo, se utilizó un análogo de blebbistatina, azidoblebbistatina, para mejorar la inhibición de la miosina bajo iluminación15,16. Esto destaca el potencial de nuevos descubrimientos debido a la capacidad de inhibición espaciotemporánea controlada de la función celular.
Los organismos 3D vivos presentan sistemas excelentes pero más delicados para manipular la dinámica de los microtúbulos a nivel de todo el animal, una sola célula o subcelular en condiciones fisiológicas. En particular, el embrión de ratón preimplantacional ofrece una visión excepcional del funcionamiento interno de la célula, así como de las relaciones intercelulares dentro de un organismo17. Los ciclos consecutivos de activación y desactivación de PST dirigidos temporal y espacialmente contribuyeron a la caracterización del puente interfase, una estructura postcitocinética entre células, como un centro organizador de microtúbulos no centrosómicos en el embrión de ratón preimplantacional16. Una configuración experimental similar demostró la participación de los microtúbulos en crecimiento en el sellado del embrión de ratón para permitir la formación de blastocistos18. Además, los PST también se utilizaron en embriones enteros de pez cebra para investigar la migración de células neuronales mediante la inhibición del crecimiento de microtúbulos en un subconjunto de células en el cerebro posterior19.
Este protocolo describe la configuración experimental y el uso de PST-1P en el embrión de ratón preimplantacional. Las instrucciones presentadas aquí también pueden guiar la aplicación de los PST para una amplia gama de objetivos, como el estudio de la segregación cromosómica y la división celular, el tráfico de carga intracelular y la morfogénesis y migración celular. Además, dichos estudios ayudarán a la implementación de PST en sistemas organoides, blastoides y otros modelos embrionarios como Caenorhabditis elegans y Xenopus laevis, así como potencialmente ampliarán el uso de PST para tecnologías de fertilización in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
La red de microtúbulos es parte integral del funcionamiento interno fundamental de una célula. En consecuencia, esto presenta desafíos en la manipulación de la dinámica de los microtúbulos en los organismos vivos, ya que cualquier perturbación en la red tiende a tener consecuencias generalizadas para todos los aspectos de la función celular. La aparición de compuestos fotoconmutables dirigidos a microtúbulos presenta una forma de manipular con precisión el citoesqueleto a nivel subcelular, con un control super…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Oliver Thorn-Seshold y Li Gao por proporcionarnos fotostatinas y consejos sobre la preparación de manuscritos, Monash Production por el apoyo a la filmación y Monash Micro Imaging por el apoyo a la microscopía.
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP2002507 del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) a J.Z. y la Beca Azrieli del Instituto Canadiense de Investigación Avanzada (CIFAR) a J.Z. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia.
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
