Spatiotemporal subcellulär manipulation av mikrotubulicytoskelettet i det levande preimplantatoriska musembryot med hjälp av fotostatiner

Summary

Typiska mikrotubulihämmare, som används i stor utsträckning i grundforskning och tillämpad forskning, har långtgående effekter på celler. Nyligen framkom fotostatiner som en klass av fotoväxlingsbara mikrotubulihämmare, som kan momentan, reversibel, spatiotemporalt exakt manipulation av mikrotubuli. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver tillämpningen av fotostatiner i ett 3D-levande preimplantatorembryo.

Abstract

Mikrotubulicytoskelettet utgör ramen för en cell och är grundläggande för intracellulär transport, celldelning och signaltransduktion. Traditionell farmakologisk störning av det allestädes närvarande mikrotubulinätverket med användning av till exempel nokodazol kan få förödande konsekvenser för vilken cell som helst. Reversibelt fotoswitchbara mikrotubulihämmare har potential att övervinna begränsningarna genom att göra det möjligt att implementera läkemedelseffekter på ett spatiotemporalt kontrollerat sätt. En sådan familj av läkemedel är de azobensenbaserade fotostatinerna (PST). Dessa föreningar är inaktiva under mörka förhållanden, och vid belysning med UV-ljus binder de till kolchicinbindningsstället för β-tubulin och blockerar mikrotubulipolymerisation och dynamisk omsättning. Här är tillämpningen av PST i det 3-dimensionella (3D) levande preimplantatoribiorembryot inställt på att störa mikrotubulinätverket på en subcellulär nivå. Detta protokoll ger instruktioner för experimentell installation, samt ljusaktiverings- och avaktiveringsparametrar för PST med hjälp av konfokalmikroskopi med levande celler. Detta säkerställer reproducerbarhet och gör det möjligt för andra att tillämpa denna procedur på sina forskningsfrågor. Innovativa fotoswitchar som PST kan utvecklas som kraftfulla verktyg för att främja förståelsen av det dynamiska intracellulära mikrotubulinätverket och för att icke-invasivt manipulera cytoskelettet i realtid. Dessutom kan PST vara användbara i andra 3D-strukturer såsom organoider, blastoider eller embryon från andra arter.

Introduction

Mikrotubuliarkitekturen varierar kraftigt mellan olika celltyper för att stödja olika funktioner ^1,2. Dess dynamiska karaktär av tillväxt och krympning möjliggör snabb anpassning till extra- och intracellulära signaler och att svara på en cells ständigt föränderliga behov. Därför kan det betraktas som det “morfologiska fingeravtrycket” som spelar en nyckelroll i cellulär identitet.

Farmakologisk inriktning av mikrotubulicytoskelettet med hjälp av småmolekylära hämmare har lett till en uppsjö av grundläggande upptäckter inom utvecklingsbiologi, stamcellsbiologi, cancerbiologi och neurobiologi 3,4,5,6,7. Detta tillvägagångssätt, även om det är oumbärligt, presenterar olika begränsningar såsom toxicitet och effekter utanför målet. Till exempel är ett av de mest använda mikrotubuli-inriktningsmedlen, nokodazol, ett kraftfullt mikrotubuli-depolymeriserande läkemedel⁸. Småmolekylära hämmare såsom nokodazol är emellertid aktiva från appliceringstillämpningen och med tanke på mikrotubulicytoskelettets väsentliga natur för många kritiska cellulära funktioner kan global depolymerisering av mikrotubuli ge off-target-effekter, vilket kan vara olämpligt för många applikationer. Dessutom är nokodazolbehandling irreversibel om inte prover tvättas fria från läkemedlet, vilket förhindrar kontinuerlig levande avbildning och därmed exakt spårning av enskilda mikrotubulifilament.

Utvecklingen av ljusaktiverade föreningar började med skapandet av fotouncaged molekyler och har förebådat en ny era i inriktning och övervakning av effekterna av mikrotubulär tillväxthämning på ett exakt och spatiotemporalt kontrollerat sätt. En familj av reversibelt fotobytbara läkemedel, fotostatiner (PST), utvecklades genom att ersätta stilbenekomponenten i combretastatin A-4 med azobensen⁹. PST är inaktiva tills de tänds med UV-ljus, varigenom den inaktiva transkonfigurationen omvandlas till den aktiva cis-konfigurationen genom reversibel isomerisering. Cis-PST hämmar mikrotubulipolymerisation genom att binda till kolchicinbindningsstället för β-tubulin, blockera dess gränssnitt med β-tubulin och förhindra dimerisering som krävs för mikrotubulitillväxt¹⁰. Bland en kohort av PST har PST-1P uppstått som en blyförening eftersom den har den högsta styrkan, är helt vattenlöslig och visar en snabb början av bioaktivitet efter belysning.

Den mest effektiva trans– till cis-isomeriseringen av PST sker vid våglängder mellan 360-420 nm, vilket möjliggör dubbla alternativ för PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på ett typiskt konfokalmikroskop kan administreras för optimal rumslig inriktning av mikrotubuli tillväxthämning. Möjligheten att fastställa platsen och tidpunkten för PST-aktivering genom 405 nm laserbelysning underlättar exakt tidsmässig och rumslig kontroll, vilket möjliggör störning av mikrotubulidynamik på en subcellulär nivå, inom subsekutsvarstiderna⁹. Alternativt, ett prisvärt LED UV-ljus tillåter belysning av hela organismen för att inducera organismomfattande störningar i mikrotubuliarkitekturen. Detta kan vara ett kostnadseffektivt alternativ för forskare för vilka den exakt tidsenad uppkomsten av hämning, snarare än rumslig inriktning, är målet. En annan egenskap hos PST är deras inaktivering på begäran genom att applicera grönt ljus med en våglängd i intervallet 510-540 nm⁹. Detta möjliggör spårning av mikrotubulifilament före, under och efter PST-medierade tillväxthämningar.

PST, även om det fortfarande är en relativt ny design, har använts i många in vitro-applikationer inom olika forskningsområden¹¹, inklusive undersökning av nya mekanismer för cellmigration i amoeboider¹², i neuroner isolerade från hjärnan hos den nyfödda musen¹³ och vingeepitelutveckling i Drosophila melanogaster¹⁴ . Andra ljusreaktiva läkemedel har visat sig vara värdefulla verktyg för riktade störningar i cellulär funktion. Till exempel användes en analog av blebbistatin, azidoblebbistatin, för förbättrad myosinhämning under belysning^15,16. Detta belyser potentialen för nya upptäckter på grund av förmågan till spatiotemporalt kontrollerad hämning av cellulär funktion.

Levande 3D-organismer presenterar fantastiska men mer känsliga system för att manipulera mikrotubulidynamik på en heldjurs-, encells- eller subcellulär nivå under fysiologiska förhållanden. I synnerhet erbjuder det preimplantatoritiska musembryot exceptionell inblick i cellens inre arbete såväl som intercellulära relationer inom en organism¹⁷. Temporärt och rumsligt riktade konsekutiva cykler av aktivering och deaktivering av PST bidrog till karakteriseringen av interfasbron, en postcytokinetisk struktur mellan celler, som ett icke-centrosomalt mikrotubuliorganiserande centrum i det preimplantatoriska musembryot¹⁶. En liknande experimentell inställning visade involveringen av växande mikrotubuli i tätningen av musembryot för att möjliggöra blastocystbildning¹⁸. Vidare användes PST också i hela zebrafiskembryon för att undersöka neuronal cellmigration genom att hämma mikrotubulitillväxt i en delmängd av celler i bakhjärnen¹⁹.

Detta protokoll beskriver den experimentella installationen och användningen av PST-1P i det preimplantatorinationella musembryot. Instruktionerna som presenteras här kan också vägleda tillämpningen av PST för ett brett spektrum av mål som att studera kromosomsegregering och celldelning, handel med intracellulär last och cellmorfogenes och migration. Dessutom kommer sådana studier att hjälpa till med implementeringen av PST i organoidsystem, blastoider och andra embryomodeller som Caenorhabditis elegans och Xenopus laevis, samt potentiellt utöka användningen av PST för in vitro-fertiliseringsteknik .

Protocol

Försöken godkändes av Monash Animal Ethics Committee under djuretiskt nummer 19143. Djur hölls i specifika patogenfria djurhusförhållanden på djuranläggningen (Monash Animal Research Platform) i strikt överensstämmelse med etiska riktlinjer. 1. Preimplantatorisk musembryosamling Superäggula och para möss som beskrivits tidigare 16,18, i enlighet med de institutionella djuretiska riktlinjerna.O…

Representative Results

I enlighet med protokollet mikroinjicerades preimplantationsmusembryon med cRNA för EB3, märkta med röd fluorescerande dTomato (EB3-dTomato). Detta möjliggör visualisering av växande mikrotubuli eftersom EB3 binder till polymeriserande mikrotubuli plus slutar24. Experimenten utfördes 3 dagar efter befruktningen (E3) då musembryot består av 16 celler. Alla andra preimplantatorisk utvecklingsstadium kan användas, beroende på vilken vetenskaplig fråga som ska u…

Discussion

Mikrotubulinätverket är integrerat i en cells grundläggande inre arbete. Följaktligen presenterar detta utmaningar för att manipulera mikrotubulidynamiken i levande organismer, eftersom varje störning i nätverket tenderar att få omfattande konsekvenser för alla aspekter av cellulär funktion. Framväxten av fotoswitchbara mikrotubuli-riktade föreningar presenterar ett sätt att exakt manipulera cytoskelettet på en subcellulär nivå, med överlägsen kontroll för induktion och reversering av mikrotubulär til…

Materials

Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides – LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes – 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch – Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice – wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes – Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss