ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית
Summary
ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.
Abstract
דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה מולדת התורשתית בעיקר בתכונה אוטוזומלית רצסיבית. ההפרעה גורמת להפרעה בתנועת הריסונים, מה שמוביל לפגיעה חמורה בפינוי רירית (MCC). אם לא מאובחנים או מאובחנים מאוחר מדי, המצב מוביל להתפתחות ברונכיאקטזיס ונזק חמור לריאות בהמשך החיים. רוב השיטות לאבחון PCD גוזלות זמן רב ודורשות משאבים כלכליים נרחבים כדי לבסס אותן. ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA) הוא כלי האבחון היחיד להמחשה וניתוח של תאי נשימה חיים עם ריסונים פועמים במבחנה. זה מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, אמין מאוד ככלי אבחון עבור PCD. בנוסף, אמצעי אבחון קלאסיים כגון מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) אינם ישימים עבור מוטציות מסוימות מכיוון ששינויים מורפולוגיים נעדרים.
מאמר זה מתאר את תהליך איסוף תאי אפיתל נשימתיים, את ההכנה הנוספת של הדגימה ואת התהליך של HSVMA. כמו כן, אנו מתארים כיצד ניתן לשמור בהצלחה על תאים מוברשים ללא פגע ולהכות על ידי השארתם במדיום מזין לאחסון והובלה לאתר החקירה במקרים בהם למרפאה אין את הציוד לביצוע HSVMA. כמו כן מוצגים סרטונים עם דפוסי הכאה פתולוגיים מחולים עם מוטציה בגן שרשרת כבדה 11 של זרוע הדיינין (DNAH11), שלא ניתן לאבחן עם TEM; התוצאה של HSVMA לא חד משמעי עקב זיהום של דרכי הנשימה העליונות, כמו גם צחצוח לא מוצלח עם superimposition של תאי דם אדומים. במאמר זה, ברצוננו לעודד כל יחידה העוסקת בחולי ריאות ומחלות ריאה נדירות לבצע HSVMA כחלק מהאבחנה השגרתית היומית שלהם עבור PCD או לשלוח את הדגימות למרכז המתמחה בביצוע HSVMA.
Introduction
דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה גנטית תורשתית נדירה, הגורמת להפרעות בתנועת הריסונים המכים. אם לא מאובחנים, זה מוביל לנזק חמור לריאות בהמשך החיים עקב פגיעה חמורה של MCC. בעבר הוערך כי שכיחותו נעה בטווח של 1:4,000 עד 50,000. בשל שיפור מתמיד באבחון ומודעות גוברת למצב, עדכונים על שכיחות ה- PCD מצביעים על כך שהוא עשוי להיות נפוץ הרבה יותר וכנראה בטווח של 1:4,000 עד 20,000 במקום 1,2. עם זאת, חולים עם PCD עדיין מאובחנים בתת-אבחון או מאובחנים מאוחר מדי 1,3. לכן, תינוקות עם סיטוס אינברסוס מולד ו/או הטרוטקסיה או רינוריאה פרינטלית, מצוקה נשימתית בילודים, אף חסום וקשיי האכלה צריכים להיות חשודים ב-PCD. בהמשך החיים, דלקת אוזניים כרונית, דלקת ריאות חוזרת ונשנית, רינוזינוסיטיס ושיעול רטוב כרוני וטיפוסי עקב פגיעה ב-MCC הם הסימפטומים המוכרים של PCD, אשר בשילוב עם ברונכיאקטזיס ותפקוד ריאות לקוי, ממשיכים לתוךהבגרות 2.
ניתן לאבחן חולים החשודים כבעלי PCD באמצעות כלי אבחון שונים. TEM נחשב בעבר לתקן הזהב לאבחון קו ראשון. עם זאת, עד 30% ממקרי ה-PCD אינם מראים מבנה-על חריגשל 1,3,4,4,5,6, מה שדורש גישה אבחנתית שונה. לכן, מספר גדל והולך של מרכזים וההנחיות של החברה האירופית לנשימה (ERS) מציעים שילוב של תחמוצת החנקן באף (nNO) ו- HSVMA כאבחון קו ראשון 1,7,9,10. HSVMA ו-nNO הן גם האפשרויות החסכוניות ביותר בזיהוי מטופל עם PCD11. עם זאת, גם אם הבדיקות הגנטיות נכללו באבחון, יש לזכור כי אין כיום בדיקה עצמאית או שילוב של בדיקות שיכולות לכלול PCD בוודאות של 100% 8,9,10.
מבין אפשרויות האבחון הזמינות, HSVMA היא הבדיקה היחידה המתמקדת בתאי נשימה חיים, מצופים ריסונים ומעריכה את תבנית הפעימה הציליארית (CBP) ואת תדירות הפעימה הציליארית (CBF). בניגוד ל-TEM, התוצאות של HSVMA זמינות במהירות, בדרך כלל ביום הבדיקה, בעוד שתוצאות ה-TEM עשויות להגיע חודשים לאחר נטילת הדגימה. ניתן ליישם HSVMA עבור כל קבוצות הגיל, בעוד ש- nNO דורש רמה גבוהה של תאימות; ניסיונות להשתמש בו מתחת לגיל 5 שנים הם בדרך כלל לא מוצלחים10. בידיים מנוסות, HSVMA יש רגישות מעולה וספציפיות לאבחון PCD ב 100% ו 96%, בהתאמה12.
מאמר זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע HSVMA, כולל קצירת תאי נשימה מצופים ריסונים מהטורבינט הנחות של האף, שימור תאים שנקטפו במדיום המזין את התאים להובלה לאתר החקירה, ותהליך ניתוח וידאו מיקרוסקופי לקביעת CBF ו- CBP. בנוסף, מוצגים כמה קטעי וידאו של מטופלים, המשווה בין CBPs ו- CBFs רגילים לתפקוד ריסונים לא תקין (וידאו 3, וידאו 4, וידאו 5, וידאו 6, וידאו 7 ווידאו 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תהליך האבחון עבור PCD באמצעות HSVMA מתואר ונדון לאור אבחון קו ראשון. למרות היותו קל יחסית להקמה,חסכוני 11, ושיטה אמינה בידיים מנוסות12, HSVMA אינו אמצעי אבחון ללא מכשולים. CBF ו- CBP חריגים עשויים להיות תוצאה של זיהום משני, מה שמוביל לדלקת של אפיתליה ברונכו-נשימתית<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להביע תודה מיוחדת לאחות הילדים גברת יוהנה יובנקוסקי על עזרתה המצוינת עם הצחצוחים. אנו רוצים גם להביע תודה מיוחדת לפרופסור היימוט עומרן (מרפאת האוניברסיטה מינסטר, UKM) על מתן רשות להשתמש בדמות הסכמטית של תנועה סילארית רגילה מאתר האינטרנט שלהם. לבסוף, ברצוננו להודות למר אלן בראון BA (Hons), PGCE, על הגהת כתב היד.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
